表没食子儿茶素没食子酸酯对黄曲霉毒素B1诱导大鼠急性肝损伤的抗氧化作用

赵静芳 邓志杰 肖德强 黄丰 高伟 张勇胜 潘剑 邓祥发 鲁力广西医科大学公共卫生学院，广西高校高发疾病预防与控制研究重点实验室（南宁500）；广西医科大学第一附属医院（南宁 500）；广西医科大学基础医学院（南宁500）

黄曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1）是由广泛存在于自然界中的黄曲霉和寄生曲霉所产生的一种毒素，其毒性是氰化物的10倍、砒霜的68倍，同时还具有致突变性、致畸性和致癌性。AFB1主要污染粮油及其制品，如花生、玉米、大米、棉籽、花生油、玉米油等。在高温高湿地区，一些粮油及其制品在生长、收获和储存过程中较易被污染，对人类健康构成极大威胁［1］。目前我国AFB1污染问题仍旧十分严峻，如何减少或消除AFB1的摄入及对机体健康的影响，降低肝癌造成的危害成为难题。AFB1导致的肝癌属于高度恶性肿瘤，病程短、进展快、治疗难、易复发，如果仅依靠现有治疗方法难以有效遏制癌细胞的蔓延，预防才是控制疾病最具成本效益的长期战略。

表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是从绿茶中提取分离出的最有效的生物活性物质。随着人们对它的深入研究，越来越多的证据表明EGCG具有抗氧化［2］、抗炎症［3］、抗肿瘤［4-5］和保护免疫系统［6］、神经系统［7］及心脑血管系统［8］、缓解代谢综合征［9］等方面的作用。EGCG在干预AFB1引起的肝损伤作用方面，目前国内外尚未见相关报道，具有广阔的研究前景。本研究旨在探讨EGCG抗AFB1致急性肝损伤的干预作用，同时为EGCG干预AFB1引起肝损伤提供临床依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 50只SPF级雄性Sprague⁃Dawley（SD）大鼠，体质量180～220 g，由广西医科大学实验动物中心提供（许可证号SCXK桂2014⁃0002）。实验期间大鼠自由摄取食物（斯莱克普通标准饲料）和水，养殖环境12 h昼夜交替，温度（23±1）℃，湿度（70±10）%。

1.2 主要试剂与仪器主要试剂AFB1（美国Sigma公司）；EGCG（成都普瑞法公司）；DMSO（法国MP公司）；过氧化氢酶（CAT）、总超氧化物歧化酶（SOD）、总谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）的测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）；Beckman Allegra X⁃15R离心机；日立7600⁃020全自动生化分析仪；life EVOS FL全自动荧光倒置显微镜；LEI⁃CA TP1020组织脱水机；LEICA EG1160组织包埋机；LEICA RM2235轮转切片机；Thermo Multiskan全波长酶标读数仪。

1.3 动物分组及处理 大鼠适应性饲养7 d后，随机分为空白组、AFB1组、EGCG低剂量干预组（简称低E干预组）、EGCG高剂量干预组（简称高E干预组）以及EGCG组，每组10只。低E干预组灌胃25 mg/kg EGCG，高E干预组及EGCG组灌胃100 mg/kg EGCG，空白组及AFB1组则灌胃0.5 mL双蒸水，每天1次，持续5 d。AFB1组、低E和高E干预组于第6天单剂量腹腔注射AFB12 mg/kg，空白组及EGCG组则予以等量双蒸水腹腔注射，染毒后各组大鼠继续以EGCG或双蒸水继续灌胃。所有大鼠于AFB1给药48 h后称量大鼠终体质量，腹腔注射1%苯巴比妥麻醉后打开腹腔腹主静脉取血，取血后迅速移除肝脏并用预冷生理盐水清洗后吸干称重，剪肝大叶一块约0.5 cm×0.5 cm×1 cm大小的组织浸泡在福尔马林溶液中，充分固定后用于组织病理学研究，其余肝组织则用冻存管分装后于液氮急冻，保存于-80℃超低温冰箱保存备用。

1.4 指标与方法 脏器指数计算：肝指数（%）=肝湿质量/体质量×100%；脾指数（%）=脾湿质量/体质量×100%；肾指数（%）=肾湿质量/体质量×100%。血清肝功能指标的测定：所取血样静置约1 h，3 500 r/min、4℃离心10 min分离制备血清。用日立自动生化分析仪检测血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、门冬氨酸氨基转移酶（AST）和碱性磷酸酶（ALP）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）含量。肝组织病理学检验（HE染色）：肝组织在福尔马林溶液中充分固定后，经过脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片、捞片、烤片、脱蜡、复水、苏木素染色、洗脱、伊红复染、清洗、晾片、封片一系列步骤后，通过光学显微镜观察肝组织结构及其病理变化。肝组织抗氧化指标的测定：取适量肝脏组织，用电动匀浆机进行匀浆，按试剂盒说明书对CAT、GSH、SOD水平进行测定；取适量血清，按试剂盒说明书对MDA水平进行测定。

1.5 统计学方法 数据采用SPSS 19.0统计分析，计量资料用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，分析前先检查方差齐性，方差齐时采用最小显著差法，方差不齐时采用Tamhane′s法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠存活及生长状况 实验期间各组大鼠均无死亡。空白组大鼠毛色正常、顺滑有光泽，正常活动，精神状态、食欲良好；AFB1组大鼠精神萎靡，毛色黯淡，活跃度及食欲有所下降；而EGCG干预组大鼠与AFB1组相比，生长状况有不同程度的改善；EGCG组与空白组相比，没有变化。

2.2 EGCG对AFB1致急性肝损伤大鼠的体质量变化及脏器指数的影响 与空白组比较，EGCG组没有变化，但AFB1组大鼠不仅体质量显著降低（P＜0.05），而且肝、脾、肾指数明显升高（P＜ 0.05）；与AFB1组比较，EGCG干预组体质量明显升高，肝、脾、肾指数明显降低（P＜0.05）；EGCG组与空白组相比，体质量、脾、肾指数没有变化，见表1。

2.3 大鼠肝组织病理学变化（HE染色） 各组肝组织病理学HE染色代表图见图1。空白组大鼠的肝组织结构正常，肝小叶的构造完好清晰，肝细胞以中央门静脉为核心呈放射状整齐排列，肝细胞多呈多边形，边缘清晰，细胞核呈圆形，位于细胞中心，核仁清晰，胞质均匀；与空白组相比，AFB1组大鼠的肝小叶结构损伤严重，肝小叶内可见散在肝细胞点，同时出现了点片状坏死，汇管区明显增大且炎症细胞浸润严重，核大，有的可见双核，细胞形态各异、大小不均；EGCG干预组的肝组织切片显示，虽各剂量干预组均可见不同程度的病变，但其肝小叶结构都已基本恢复正常，肝细胞索排列规则，肝细胞变性及肿胀程度明显减轻，汇管区炎症浸润明显得到了抑制，低E干预组效果优于高E干预组；EGCG组相对于空白组没有差异。由此可见，EGCG可以减轻AFB1所致大鼠的急性肝损伤，同时表明100 mg/kg EGCG对大鼠肝脏无影响。

表1 EGCG对AFB1致急性肝损伤大鼠体质量及脏器指数影响Tab.1 Effect of EGCG on body weight and visceral index of AFB1induced acute liver injury in rats（n=10） ±s

表1 EGCG对AFB1致急性肝损伤大鼠体质量及脏器指数影响Tab.1 Effect of EGCG on body weight and visceral index of AFB1induced acute liver injury in rats（n=10） ±s

注：与空白组比较，aP＜0.05；与AFB1组比较，bP＜0.05

组别空白组AFB1组低E干预组高E干预组EGCG组体质量244.90±11.69 225.60±13.72a 228.30±6.80a 236.3±14.01 242.3±3.83b肝指数0.029±0.001 0.033±0.002a 0.030±0.002b 0.029±0.002b 0.027±0.001ab脾指数0.002 1±0.000 4 0.002 6±0.000 4a 0.002 4±0.000 3a 0.002 2±0.000 4b 0.002 3±0.000 3肾指数0.007 5±0.000 5 0.008 5±0.000 7a 0.007 6±0.000 5b 0.007 5±0.000 3b 0.007 4±0.000 5b

图1 EGCG抗AFB1致大鼠急性肝损伤作用的病理学观察Fig.1 Pathological observation on the effect of EGCG on acute liver injury induced by AFB1in rats（HE staining，×200）

2.4 EGCG对AFB1致急性肝损伤大鼠血清肝功能的影响 AFB1染毒后，大鼠肝功能指标ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP相较于空白组均有明显升高（P＜0.05），而EGCG各剂量干预后可显著降低AFB1对大鼠肝脏的损伤作用，其肝功能指标明显好转（与AFB1组相比，P＜0.05）。EGCG组与空白组比较，差异无统计学意义，见表2。

表2 EGCG对AFB1致急性肝损伤大鼠血清ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP的影响Tab.2 Effect of EGCG on serum ALT，AST，TBIL，DBIL and ALP in rats with acute liver injury induced by AFB1（n=10）±s

表2 EGCG对AFB1致急性肝损伤大鼠血清ALT、AST、TBIL、DBIL、ALP的影响Tab.2 Effect of EGCG on serum ALT，AST，TBIL，DBIL and ALP in rats with acute liver injury induced by AFB1（n=10）±s

注:与空白组比较，aP＜0.05；与AFB1组比较，bP＜0.05

组别空白组AFB1组低E干预组高E干预组EGCG组ALT（U/L）53.80±6.91 4 184.00±364.53a 2 639.00±346.54ab 1 908.00±246.98ab 55.80±6.80b AST（U/L）111.10±10.38 5 422.20±265.70a 3 536.20±282.88ab 2 513.10±449.24ab 128.10±21.11b TBIL（μmol/L）2.27±0.34 33.75±3.41a 21.10±3.79ab 13.97±3.29ab 2.47±0.51b DBIL（μmol/L）0.68±0.18 20.55±2.36a 12.66±2.04ab 5.81±2.13ab 0.54±0.26b ALP（U/L）226.60±39.17 461.00±20.26a 321.30±33.56ab 282.80±35.18ab 277.20±60.49b

2.5 EGCG对AFB1所致急性肝损伤大鼠抗氧化能力的影响 AFB1染毒可致大鼠抗氧化能力明显下降，与空白组相比其肝组织CAT、GSH、SOD水平降低（P＜0.05），血清MDA水平升高（P＜0.05）；EGCG干预后其抗氧化能力有所恢复，与AFB1组相比大鼠肝组织CAT、GSH、SOD水平增高（P＜0.05），血清MDA水平降低（P＜0.05）。EGCG组与空白组比较，差异无统计学意义，见表3。

表3 EGCG对AFB1致急性肝损伤大鼠肝组织CAT、GSH、SOD及血清MDA水平的影响Tab.3 Effect of EGCG on SOD and MDA levels in liver tissue of AFB1induced acute liver injury in rats（n=10） ±s

表3 EGCG对AFB1致急性肝损伤大鼠肝组织CAT、GSH、SOD及血清MDA水平的影响Tab.3 Effect of EGCG on SOD and MDA levels in liver tissue of AFB1induced acute liver injury in rats（n=10） ±s

注：与空白组比较，aP＜0.05；与AFB1组比较，bP＜0.05

组别空白组AFB1组低E干预组高E干预组EGCG组CAT（U/mg prot）82.44±4.34 48.55±11.06a 66.11±12.24ab 68.09±9.94ab 79.48±7.13b GSH（μmol/L）2 203.05±207.29 1 145.97±260.36a 1 495.49±213.60ab 1 712.04±159.34ab 2 421.03±294.74b SOD（U/mg prot）390.32±26.03 295.67±32.37a 362.15±49.86b 373.37±42.43b 395.36±56.92b血清MDA（nmol/mL）2.14±0.23 8.93±2.08a 4.90±2.56b 4.60±1.67ab 2.44±0.22b

3 讨论

肝癌是世界上第6大最常见的癌症，也是全世界癌症死亡的3大主要原因之一［10］。据报道，我国每年约有38.3万人死于肝癌，是全世界肝癌死亡病例数的51%，且发病和死亡水平居高不下，对居民生命健康危害极大，严峻的局势给我国社会及医疗带来了沉重的负担［11］。流行病学研究表明，AFB1污染诱发的肝癌易发生于气候炎热潮湿的发展中国家，如东南亚地区以及撒哈拉以南的非洲地区；在我国则呈现出南高北低的现象。实验研究证明，EGCG可从诱导凋亡、周期阻滞、信号传导、抑制肿瘤侵袭等多方面多途径多靶点地抑制肿瘤的增殖和转移，从而安全有效地预防肿瘤发生。HAN等［12］的实验通过EGCG在氧化应激作用机制下活化Nrf2信号通路，抑制了砷引起的肝脏病理损伤及氧化损伤，表明EGCG具有较好的预防化学性肝损伤作用。EGCG是从绿茶中提取的一种具备高效生物活性、无毒无害的化合物，是天然的自由基清除剂和抗氧化剂［13］，更是成为肿瘤预防药物的安全选择，且目前已广泛应用于食品、医药、保健等领域。

研究证实ALT、AST是存在于肝细胞浆内的可溶性酶，当肝组织、肝细胞遭受损害时，细胞膜通透性增加，ALT、AST释放入血，故血清ALT、AST水平的高低可反映肝细胞损伤程度［14］。在本实验中，使用EGCG进行干预后的AFB1染毒大鼠，能够有效降低血清中ALT、AST水平，这表明EGCG能够起到干预AFB1所致肝损伤的作用。抗氧化防御系统包括内源性和外源性两大部分，内源性防御系统主要包括SOD、CAT、血红素加氧酶和非酶低分子量清除剂（如GSH），外源性防御系统为抗氧化剂，根据其来源可分为天然抗氧化剂（如类胡萝卜素，饮食为主要来源），及由工业合成的合成抗氧化剂（如n⁃乙酰半胱氨酸），两大系统的共同作用能够维持或重建氧化还原稳态［15］。AFB1致肝损伤的发病机制与氧化应激密切相关，肝脏酶系在代谢过程中生成大量自由基，而这些自由基又可直接攻击细胞中的蛋白质、DNA等，其中脂质过氧化是自由基介导损伤的主要表现之一，细胞抗氧化酶水平降低，引起机体氧化应激损伤［16-17］。MDA是脂质过氧化过程中的重要产物，它反映了体内脂质过氧化的氧化程度和细胞遭受自由基损伤的程度；SOD为最重要的抗氧化酶之一，有着防止细胞氧化损伤的作用；GSH、CAT能够间接地反映机体细胞受自由基攻击的严重程度［18-19］。

本实验降低了AFB1染毒大鼠血清MDA水平，同时提高了肝组织CAT、SOD和GSH水平，提示EGCG能够起到干预AFB1所致肝损伤的作用，其机制可能为在内源性和外源性防御系统的共同作用下，提高了体内自由基清除剂水平及抗氧化酶的活性，阻止了脂质过氧化过程，从而影响膜流动性、破坏了膜蛋白，通过减少氧化应激保护了机体免受氧自由基的攻击，但其具体分子作用机制尚需进一步研究。

本研究初步揭示了EGCG对AFB1致大鼠急性肝损伤的干预作用与机制，为今后对AFB1致（亚）慢性肝损伤和肝癌的干预研究奠定了基础，也为今后预防AFB1肝损伤作用的膳食指导及其治疗药物的开发提供了理论依据。但本实验研究对象为动物，所取标本为动物组织，与人体病理机制有一定差距，同时本实验未从分子机制上深入探讨，从而未能从多方面验证EGCG干预AFB1所致肝损伤的效果。人体有效的临床实验研究及分子机制有待进行，方可进一步验证EGCG对AFB1所致肝损伤的干预效果。

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