人肾透明细胞癌荷瘤裸鼠成瘤细胞浓度检测及相关研究

张鲲鹏，邹泓

（石河子大学医学院，新疆 石河子832002）

肾癌透明细胞癌（Renal Cell Carcinoma）是起源于肾上皮细胞的恶性肿瘤。占全部肾脏肿瘤的85%以上[1]。在世界范围内，肾癌的死亡病例每年超过10万例，肾癌对放射治疗、化学治疗和激素治疗均不敏感[2]，但其免疫原性极强，因此肾癌的免疫治疗一直是研究的热点。而制约肾癌免疫治疗研究的一大障碍是缺乏与人体免疫环境近似的实验动物模型。应用动物模型可以缩短研究时间，便于观察并干预肿瘤发生、发展的全过程，对于研究肿瘤的病理变化、发生发展机制、治疗及预防有重要意义。

转移瘤模型是最常用的一种实验动物模型，具有操作简单、成瘤率高、成瘤时间相对可以控制等优点。但转移瘤模型成瘤条件尚不统一，其中差别最大的就是成瘤细胞浓度，目前国内外学者最常用成瘤浓度之间浓度相差10 倍，探讨最佳的成瘤浓度，为保证裸鼠在短时间内达到成瘤要求是有意义的。本研究选择BALB/C 品系制作肾透明细胞癌裸鼠模型，注射部位选择血运丰富的前肢腋下，重点探讨最佳成瘤细胞浓度。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂和耗材

1640、MEM 培养基（美国Invitrogen 公司）；胰蛋白酶含0.25%EDTA 消化液（北京索莱宝公司）；PBS（上海生工公司）；胎牛血清（以色列Biolnd 公司）；15ml 离心管（美国Corning 公司）；冻存管（美国Corning 公司）；0.22 μm 一次性针头式滤器（美国Millipore 公司）；1000、200、10 μL 无酶枪头（上海生工公司）；雌性BALB/c-nu 裸鼠 （北京中国医学科学院实验动物研究所）。

1.1.2 主要仪器设备

SW-CJ-1F 型超净台（苏州博讯公司）；371 型CO2培养箱（美国ThermoFisher 公司）；IX71 型倒置荧光显微镜（日本Olympus 公司）；TDL-50B 型离心机（上海安亭科学仪器厂）；移液器（德国Eppendorf 公司）；高压蒸汽灭菌锅（日本SANYO 公司）；1810-B型石英自动双重纯水蒸馏器（江苏丹阳门石英玻璃厂）；HHW-21 型水浴箱（北京光明医疗仪器厂）；BCD-539WT 型冰箱（海尔公司）；AB204-E 型电子天平（美国MonoBloc 公司）；CO2恒温培养箱 （美国Thermo Forma）

1.1.3 实验材料及条件

人肾透明细胞癌细胞株（786-0）和人肾透明细胞癌胸水转移细胞株（ACHN，与786-0 属同源细胞系），购于中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库（上海），单层贴壁细胞，含10%FBS（胎牛血清，Fetal bovine serum）的1640（786-0）和MEM（ACHN）培养基培养于CO2恒温孵育箱中（37 ℃，CO2浓度为5%）。细胞在培养过程严格规培操作，无支原体、细菌、真菌等污染。4-6 周龄雌性BALB/c-nu 裸鼠48只（786-0 和ACHN 细胞株各4 组，每组6 只），体重16-17 g，由北京中国医学科学院实验动物研究所提供，由新疆医科大学第一附属医院动物研究院代养，饲养于SPF 级（Specific pathogen Free，SPF，无特定病原体）环境中，高压灭菌的标准饲料和水喂养。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及细胞悬液配制

选择786-0 细胞株和ACHN 细胞株在37 ℃、含5% CO2的细胞培养箱中培养并连续传代（传代20代以内），当细胞生长成致密单层，融合度达到80%～90%且状态良好为注射标准，传代（第12 代）到需要的细胞量，每次传代均在显微镜下观察细胞状态，保证细胞在对数生长期传代。消化细胞：胰酶消化1 min，含血清培养基终止消化，转入离心管中离心（1000 r/min 离心5 min），去上清液，加无血清培养基混匀，转移到离心管中备用。细胞计数板计数：取990 微升培养基+10 微升细胞悬液混匀，根据公式总细胞数= 计数细胞数/4×100×104，连续计数3 次，取平均值，根据浓度梯度1×106、3×106、5×106、10×106，计算需要细胞悬液量，配制200 μL/注射点（每只注射0.2 mL），浓度分别为1×106/200 μL（A 组）、3×106/200 μL（B 组）、5×106/200 μL（C 组）、10×106/200 μL（D 组）。

1.2.2 成瘤实验及病理学观察

将48 只裸鼠随机分成8 组，按照设计浓度梯度分别注射786-0 细胞株与ACHN 细胞株悬液，为避免混淆裸鼠分笼喂养并标记。接种前测量裸鼠体重，此后每周称量体重；从开始观察到注射部位形成硬结开始，每周用游标卡尺测量肿瘤长短径，根据公式体积=长×短2/2，直到最小肿瘤达1 cm，处死裸鼠，剥离肿瘤，记录肿瘤大小和重量，查看其它组织器官是否有转移瘤。切开肿瘤肉眼观察记录，制作HE 切片，显微镜下观察肿瘤的形态及坏死状况。

1.2.3 统计学处理

所有数据以均数±标准差（±S）表示，应用SPSS20.0 统计软件进行处理分析，组间比较用单因素方差分析；P＜0.05 有统计学差异。

2 结果

2.1 细胞培养及处理前裸鼠状况

人肾透明细胞癌细胞株（786-0）和人肾细胞癌胸水转移细胞株（ACHN）细胞生长成致密单层，融合度基本达到80-90%，细胞饱满，呈对数生长，且状态良好，均达到注射的标准，注射前为第12 代。裸鼠整体身体良好，活动良好，无弓背过瘦，称重平均17 g，符合4-6 周龄裸鼠体重，裸鼠均无毛，皮肤浅红，饮食正常。

2.2 成瘤过程观察记录

裸鼠SPF 级环境饲养，于前肢腋下注射肿瘤细胞后观察：第一周注射点基本无明显变化；从第二周开始（约第10 天开始），出现小结节状肿块，触之较硬，记录肿瘤长短径；第三周除A 组外，B、C、D 组裸鼠均成瘤，肿瘤大小随注射肿瘤细胞浓度增加而增大，肿瘤呈结节状，表面皮肤呈浅黄色。肿瘤较小，不影响裸鼠活动，尚未见恶病质等症状，记录肿瘤大小；第四周时，D 组裸鼠肿瘤最大，肿瘤表皮有明显破溃点，B、C 组裸鼠成瘤均稍小于D 组，A 组未成瘤。

根据记录的肿瘤大小（表1）绘制裸鼠肿瘤生长曲线（图1）。裸鼠体重记录显示：裸鼠体重增加情况相近，每周增加约1 g，保证所有裸鼠接近于正常生长，与人类肾癌患者的早期临床表现相接近。

表1 裸鼠肿瘤体积 S，n=6Tab.1 Tumor volume in nude mice S，n=6

生长曲线（图1） 显示：B 组和C 组裸鼠肿瘤生长速度和大小基本相近，即注射后一个月成瘤约1 cm3，而D 组10×106/ 点裸鼠肿瘤生长较快，注射后三周成瘤约1 cm3，第四周肿瘤接近1.4 cm3，且均有破溃点，已不利于检测，属恶病质前期。

图1 裸鼠肿瘤生长曲线Fig.1 Tumor growth curve in nude mice

2.3 瘤体取材，制作切片HE 染色，镜下观察

第四周采用高浓度二氧化碳处死裸鼠，剥离肿瘤，沿最大面切开，肉眼可见：B 组（图2A、2E）肿瘤切面灰黄，基本未见明显坏死，C 组（图2B、2F）肿瘤切面灰黄色，囊实性，囊样结构内可见灰黄色液状坏死物，D 组（图2C、2G）肿瘤切面大部分为囊性，囊内见多量液状坏死物，实性部分少。

常规制作HE 切片，镜下观察：786-0（图2D）与ACHN（图2H）细胞成瘤后，细胞卵圆形、梭形，胞浆透亮，与肾透明细胞癌细胞相似，说明保留了原发肿瘤的形态特点。各组比较，B 组肿瘤细胞实性片状，细胞卵圆形、梭形，胞浆透亮，坏死稀少，C 组肿瘤细胞形态与B 组相似，但肿瘤组织中央可见液化性坏死区，D 组镜下肿瘤大部分区坏死，存活细胞少，显示肿瘤镜下形态与肉眼观察结果一致。

图2 裸鼠剥离肿瘤切片HE 染色Fig.2 HE staining of dissected tumor sections in nude mice

3 讨论

裸鼠成为肿瘤模型的工具是因为其胸腺缺乏，细胞免疫功能缺如，免疫排斥反应低下，在一定程度上模拟了人类患者免疫机制紊乱而导致的肿瘤失控性生长。自1969年Rygaard 首次成功的将人结肠癌移植到裸鼠体内开始，裸鼠成瘤就被广泛的用于基础和临床研究。目前国内外常用的动物模型有四种类型：自发瘤模型、诱导模型、移植模型、转基因动物模型。转移瘤模型有操作简单、成瘤率高、成瘤时间相对可以控制等优点，而且制作转移瘤可操作性强，降低个体差异对肿瘤生长的影响，故转移裸鼠模型广泛应用[3-13]。

肾癌786-0 细胞株来自于原位肿瘤分离，肾癌ACHN 源自人肾细胞癌胸水转移分离，其恶性程度均较高，均具有较高的成瘤性。通过文献发现成瘤裸鼠模型中成瘤浓度各家报道不一，差距较大，Teruo[14]、Kristy[1]等 采用1×106每 个 点，Zhang[9]等 采用10×106每个点，最小与最大有十倍之差，故我们探索其最佳成瘤浓度；有报道称10×106/200 μL 皮下成瘤，21 d 均可出现皮下结节。Sharkey[15]报道，肾癌细胞株裸鼠平均成瘤率为50%。本实验发现：成瘤率在3×106～10×106随浓度增加而增加，当浓度大于3×106时，裸鼠皮下成瘤率为100%，而浓度为1×106时，裸鼠不成瘤，可见上述报道不成瘤原因可能是接种细胞浓度低所致。Ciardiello[16]等接种ACHN 细胞株10×106/200 μL 于裸鼠皮下，肿瘤在1 周时长至1 cm3。本实验同等细胞量组成瘤率与之相符，而成瘤大小稍慢，第2 周长至1 cm3，可能与细胞反复冻融和多次传代导致细胞生物学特性改变和成瘤率下降有关。Wang[17]报道，肾癌ACHN 细胞株裸鼠移植瘤部位在腋下成瘤率高，接种肿瘤细胞在传代20 代以内成瘤率高，故本实验选用前肢腋下成瘤，接种肿瘤细胞为第12 代，以保证本实验不受接种部位和细胞代数的影响。研究发现裸鼠皮下移植瘤发生转移少[18]或者较晚[19]。本实验亦未发现有明显的转移。有报道采用尾静脉注射瘤细胞建立肾癌转移模型，Wang[17]报道，尾静脉注射转移率100%，其中肺转移多见，转移瘤细胞形态与肾癌细胞吻合。肾癌主要通过血道转移，故皮下注射成瘤的转移比直接尾静脉注射转移晚，应用尾静脉注射法，肿瘤细胞可以通过血液循环直接到达容易转移的靶器官，比皮下成瘤转移更快，故采用皮下注射更易操作，实体瘤实验更合适，尾静脉注射法由于直接入血，更适合于建立转移模型，这就为肾癌转移模型指引了方向。

通过本次研究发现，在控制细胞代数、接种部位前提下，肾透明细胞癌成瘤裸鼠最佳成瘤细胞浓度为3×106/ 点（786-0 和ACHN 相同），肿瘤细胞注射浓度在3×106-10×106范围内，随着细胞注射浓度的增加，肿瘤生长越快。我们较为成功的完善了人肾癌（786-0、ACHN）细胞裸鼠移植瘤模型。在接下来的工作中，我们将以此为基础，结合相关研究进展，开展临床新鲜肿瘤组织样本制作裸鼠成瘤模型，不断积累裸鼠成瘤的实验数据。