塞尼卡病毒A在BHK-21细胞中培养条件探索

陈丽萍 兆丰华生物科技（福州）有限公司 福州 350014

塞尼卡病毒A（Senecavirus A，SVA），原名塞尼卡谷病毒（Seneca valley virus，SVV）是引发猪原发性水疱病（PIVD）的主要原因，可导致感染猪的鼻吻、蹄冠部出现水疱性病变，新生仔猪死亡。近年来，SVA已经波及美国、加拿大、巴西、泰国、中国等，危害养猪业健康发展[1-6]。目前，国内外仍没有可以推广使用的商品化SVA疫苗，疫苗制备方法的报道最早出自中国农业科学院兰州兽医研究所[7]。本文通过试验从接种方法、细胞浓度、血清含量及收毒时间等因素对SVA在BHK-21细胞中培养的影响，从而了解SVA在BHK-21细胞中增殖的最适条件，为疫苗生产提供数据参考。

1 试验材料

1.1 仪器设备 细胞培养瓶，CO2培养箱，倒置显微镜，恒温水浴锅，96孔板。

1.2 试验试剂MEM培养基（购自Gibco），新生牛血清（购自润生生物），BHK-21细胞，SVA（公司自主分离毒株），胰酶-EDTA溶液（自配）。

2 试验方法

2.1 两种接种方法对比试验 用MEM培养基(含8%新生牛血清)作为BHK-21细胞的营养液，按常规方法培养细胞[8]。将长满致密单层的BHK-21细胞用胰酶-EDTA消化传代（比例为1:3），随机将细胞分成2组，一组同步接种1% SVA；另一组待细胞生长约90%时，弃去营养液，异步接种1% SVA，加入MEM维持液（含2%新生牛血清）；设健康细胞作对照。接毒后细胞放37℃、5% CO2培养箱中培养。培养12 h后每3 h观察一次，18 h后每3 h、每组随机收获2瓶，直至30 h，收获后反复冻融2次，测定TCID50。

2.2 不同细胞浓度培养同时收获对比试验 将长满致密单层的BHK-21细胞消化后，按1:2、1:3、1:4和1:5的比例稀释传代，待细胞生长至90%时，弃去营养液，加入MEM维持液，接种1%SVA；设健康细胞作对照。接毒24 h后同时收获细胞，反复冻融2次后测定TCID50。

2.3 不同细胞浓度相同病变程度收获病毒对比试验 按2.2中的条件培养SVA，当CPE达80%以上时收获细胞，反复冻融2次后测定TCID50。

2.4 不同时间收获对SVA增殖的影响 将长满致密单层的BHK-21细胞消化后，按1:3、1:4比例传代，每组18瓶，待细胞生长约90%时，弃去营养液，加入MEM维持液，接种1%SVA；设健康细胞作对照。从15 h起每3 h、每组随机收获2瓶观察病变情况，观察至39 h。反复冻融2次，测定TCID50。

2.5 不同血清含量培养的细胞接种SVA比较试验将长满致密单层的BHK-21细胞消化后，按1:3、1:4比例传代，分别用血清含量为5%、8%、10%的MEM培养，细胞生长至90%时，弃去营养液，加入MEM维持液，接种1%SVA；设健康细胞作对照。当CPE达80%以上收获病毒，反复冻融2次后测定TCID50。

2.6病毒TCID50测定 将BHK-21细胞按一定比例消化后铺于96孔板中，0.1 mL/孔，放CO2培养箱中培养24 h后接毒。将待检病毒液进行10倍倍比稀释，取10-7、10-8、10-9三个稀释度分别接种到培养板，每个稀释度6孔，0.1 mL/孔；设6孔无病毒空白对照，加入MEM维持液，0.1 mL/孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，每天观察并记录每孔细胞的CPE，采用Reed-Muench法计算TCID50。

3 结 果

3.1 两种接种方法对SVA的影响 从病变来看，异步接毒在接毒15 h病变较轻，18 h病变明显，24 h病变达80%以上；同步接毒在接毒15 h病变已经很明显，18 h大量细胞已经脱落，病变达80%以上。可见，异步接毒收获病毒液的TCID50明显比同步接种的高（见图1）。

图1 两种接种方法对比试验结果

3.2 不同细胞浓度同时收获对SVA增殖的影响细胞接种SVA后，培养24 h同时收获病毒。由图2可见，1:2、1:3比例传代时，收获病毒液的TCID50都相对较高；1:4、1:5比例传代时，收获病毒液的TCID50都相对较低。1:3比例传代细胞培养的病毒液的TCID50最高。

图2 不同细胞浓度对SVA增殖的影响

3.3 不同细胞浓度相同病变收获对SVA增殖的影响 细胞以不同比例传代后接种病毒，从CPE来看，1:5比例传代时最早出现病变，接种后18 h CPE已达80%以上；1:4比例传代时，接种后21 h CPE已达80%以上；1:3比例传代时，则在接种后24 h CPE达80%以上；1:2比例传代时，30 h CPE达到80%以上。从图2可见，1:5比例传代时，收获病毒液的TCID50都相对较低，1:2、1:3、1:4比例传代细胞培养的病毒液的TCID50都比较高。

3.4 不同时间收获对SVA增殖的影响 从CPE来看，1:4传代时，接毒后15 h已经出现明显病变，21 h、24 h CPE达80%以上，33 h细胞大部分都已脱落；1:3传代时，接毒后18 h出现明显病变，24 h、27 h CPE达80%以上，36 h细胞大部分都已脱落。由图3可见，1:4传代时，在CPE达80%以上且TCID50最高的时间段为21~27 h；1:3传 代 时，CPE达80%以上且TCID50最高的时间段为24~30 h。

图3 不同收获时间对SVA增殖的影响

3.5 不同血清含量培养的细胞对SVA增殖的影响从图4可知，传代比例为1:4时，8%血清培养病毒液的TCID50最高；传代比例为1:3时，8%、10%血清培养病毒液的TCID50都比较高，血清含量增加收获病毒液的TCID50也增加。总的来说，培养液的营养水平与收获病毒液的TCID50呈正相关。

图4 不同血清含量比对试验

4 讨 论

体外培养细胞增殖病毒时，接种时间是病毒增殖效果的重要因素[8-9]。本试验将SVA以不同接种方法接种BHK-21细胞，结果表明异步接毒收获病毒液的TCID50高于同步接毒收获病毒液。细胞浓度会影响病毒的繁殖，从而影响收获病毒的TCID50。以1:5传代的细胞，培养病毒的含量较低，而细胞传代比例为1:2～1:4的，培养病毒的含量较高，而1:2传代影响生产效率且成本高，整体来看，1:3比例传代培养SVA病毒，效价较高。

营养液中的血清含量不仅是培养液营养水平的重要体现，还对细胞生长、病毒增殖至关重要。营养水平会影响细胞的长速、周期、状态，从而影响病毒增殖。试验结果显示，采用5%血清培养，病毒含量都偏低，用8%、10%血清培养，TCID50都比较高，但考虑到血清成本较高，用8%血清含量比较适宜。

病毒的收获时间是病毒液能否在TCID50高点收获的关键因素，直接影响病毒的效价。试验结果显示，同等条件下，CPE达80%以上时收获病毒液的TCID50高于接种病毒后24 h同时收获病毒液的TCID50。

因此，根据对SVA培养试验结果，SVA在BHK-21细胞上的适宜培养条件为细胞1:3比例传代、添加8%新生牛血清培养，待细胞生长至90%比例时接种SVA，接种后培养至CPE达到80%以上收获病毒。