白刺对胃癌MGC-803细胞的抑制作用

王亚峰，谢亲建，丁晓煜，孙晓刚，罗淑平，贺葵邦

1青海省人民医院药剂科，青海 西宁 810000；2武警甘肃省总队医院；3中国人民解放军兰州总医院

白刺是蒺藜科白刺属的灌木，分枝多而密集，呈丛生状，具有较强的固沙阻沙能力，而西北属气候条件恶劣，水资源缺乏，风沙弥漫遍地的宽阔地带，白刺是一种生长在沙漠的耐寒植物，它的果实光滑圆胖，如同微型圣女果，在陕甘蒙地区又被称为“酸胖”，性温、味甘、微碱酸，具有调经活血，消食健胃的功效，用于治疗肺病、胃病、心热痛经、月经不调、消化不良等［1］。近年来有研究［2］表明白刺果的稀有金属为铬、锌、铁、锰、硒等微量元素和18种氨基酸，另外它所含的总黄酮及其衍生物是抗炎、降压、扩张冠状血管、抗癌的有效成分［3］。因此，本研究从细胞水平探讨白刺果实能否有效抑制胃癌，为以后研究白刺治疗癌症奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级昆明种小鼠50只，实验动物许可证号：SCXK(甘)2013-0002，购自兰州大学实验动物中心，体质量(18±2)g，雌雄各半。

1.2 仪器与试剂 Sartorius分析天平(SARTORIUS-BT23S)；KH-5200B超声清洗器(昆山禾木超声仪器有限公司)；Thermo CO2培养箱(thermoscientific公司)；Multiskan Spectrum酶标仪(美国Thermo Scientific公司)。小牛血清(四季青)；RPMI1640 培养基(美国 Solarbio 公司)；MGC-803细胞株(青海省人民医院惠赠)；5-FU(5-氟尿嘧啶，上海旭东海普药业有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 白刺果液的制备 白刺果500 g(来自民勤县腾格里沙漠，经兰州大学生药学教研室马教授鉴定），除去杂质和霉变果实，清水冲洗、晒干；放入圆底烧瓶煎煮，加入纯水2 500 mL，煎煮2～3次，1～1.5 h/次，过滤，合并滤液，浓缩至比重为1.025～1.030 g/mL，待用。

1.3.2 细胞培养与MTT检测 将冻存的胃癌MGC-803细胞株在37℃水浴中迅速融化，加入2 mL RPMI1640吹打后放入15mL玻璃离心管中，800rpm离心，弃去上清液，在含有10%新生小牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的RPMI 1640培养液中，在37℃，5%CO2的培养箱中培养，整个过程在无菌操作间进行。取对数生长期的胃癌MGC-803细胞，用含10%小牛血清的RPM1640培养液调整细胞密度至1.0×105/mL，接种至96孔细胞培养板，每孔100 μL。待细胞贴壁后分别加入不同浓度(25，50，100，200 mg/mL)的白刺溶液，每个浓度设3个复孔，同时设空白对照组。分别培养24、48、72小时后每孔加入 5 mg/mL的噻唑蓝(MTT)试剂10 μL，继续培养4小时，弃上清液，每孔加入DMSO 100 μL，震荡至结晶溶解后，用酶联免疫检测仪以570 nm测量波长测定各孔吸光度(A)，按以下公式计算：

抑制率(%)=(对照组-给药组)／对照组

1.3.3 PI检测细胞周期 取对数生长期胃癌MGC-803细胞，调整至每毫升2.0×105个细胞，接种于6孔板，每孔3 mL。待细胞贴壁后加入不同浓度的白刺溶液，每孔加入药物后终体积为1 000 μL。培养48小时后，消化收集细胞，800 rpm离心5分钟，弃上清。预冷磷酸缓冲盐溶液(PBS)重悬细胞，离心洗涤3次，用体积分数为70%的乙醇4℃固定过夜。上机前用预冷的PBS洗涤，加入PI染色液(含 RNA 酶 5 mg/mL)，终浓度 500 μg/mL，避光染色15分钟，300目尼龙网过滤后上流式细胞仪分析细胞DNA含量的变化，每个样本随机分析10 000个 /mL。

1.3.4瑞氏——吉姆萨染色细胞形态学的观察 取对数生长期的胃癌细胞，计数、稀释，最终细胞密度为2×106个/mL，接种于6孔板上，每孔加3 mL的细胞，接种24小时后，按照给药浓度分别为200、100、50 mg/mL 3组和空白对照组，每孔分加300 μL的白刺溶液，空白对照组用等体积培养液，培养48小时后。PBS洗涤2遍，取少量细胞离心涂片，瑞氏——吉姆萨染色，光镜下观察形态。1.3.5 毒性试验 参照文献［4-6］方法观察白刺对昆明种小鼠的毒性试验。将昆明种小鼠20只分为高剂量组、空白对照组，每组10只。2周后用断头法处死小鼠，用病理观察方法观察小鼠脏器。

2 结果

2.1 白刺溶液对胃癌MGC-803细胞的抑制作用 不同浓度白刺溶液作用于胃癌MGC-803细胞24、48、72小时均可抑制细胞增殖。随着药物浓度和作用时间的增加，该药的抑制作用逐渐增强，但作用48～72小时时抑制率的增幅逐渐减小，100～200 mg/mL作用72小时的抑制率相近，见图1。

图1 不同时间白刺溶液对胃癌MGC-803细胞的抑制率

2.2 白刺溶液对胃癌细胞周期的影响 白刺溶液对胃癌细胞周期的影响结果见图2。

图2 白刺溶液对胃癌细胞周期的影响

2.3 白刺溶液对胃癌细胞形态学的影响 光学显微镜下对照组MGC-803细胞分布均匀，大小一致，加入相同体积的RPMI1640作用细胞48小时，可见细胞无变化。加入50mg/mL白刺溶液后MGC-803细胞体积缩小，细胞不规则，细胞膜周边形成小泡，处于凋亡小体的形成中。加入100mg/mL的白刺溶液后MGC-803细胞体积连接紧密不规则，细胞膜周边有的形成小泡，处于形成凋亡小体的过程中。加入200 mg/mL的白刺溶液作用于MGC-803细胞

图3 白刺溶液对胃癌细胞形态学(HE×200)

图5 肝脏(HE×40)

图7 肺脏(HE×40)

3 讨论

胃癌是一种常见肿瘤，近年来调查表明在水土与气候条件恶劣的环境中，胃癌的发病率增高，胃癌治疗的主要手段是切除，但是复发率较高。因此，为了防止肿瘤复发与转移，延长患者的生存时间和提高患者的生活质量，减轻患者痛苦，学者们不断寻找治疗癌症的各种药物。近年来在中医传48小时，细胞数量减少，细胞出现破裂，不规则程度增大，有可能逐渐向凋亡状态过渡，见图3。

图4 心脏(HE×40)

图6 脾脏(HE×40)

图8 肾脏(HE×40)

2.4 白刺溶液对小鼠脏器的影响 光镜下心肌细胞均匀完整，未发现心肌细胞及内膜纤维化；小鼠肝小叶结构正常，肝细胞排列整齐，无坏死状态，无炎细胞浸润，汇管区有轻微的炎性细胞浸润；脾、肺、肾脏与空白对照组相比，无明显变化。由此可知，白刺溶液对小鼠的脏器没有明显不良影响，见图4—8。统理论的指导下，用中药来治疗癌症受到国内外重视［7-8］。本研究发现白刺果对胃癌MGC-803细胞具有增殖和诱导细胞凋亡作用。从图1—2可知，随着时间和药物浓度的增加，抑制率逐渐增大，但是当白刺果的浓度增大到200 mg/mL时，抑制率逐渐处于平衡状态。从形态学变化可知：细胞出现不规则形态，细胞膜周边形成小泡，处于凋亡小体的形成期，随着浓度的增大，细胞数量减少，细胞出现破裂，不规则程度增大，有可能逐渐向凋亡的状态过渡；从病理学角度可知，未见该药对小鼠脏器的损伤作用。

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