HPLC法测定养阴生肌妇炎栓中龙胆苦苷的含量*

古秋莉，刘效栓，李喜香，郭 敏

1甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050；2甘肃中医药研究院

中药复方养阴生肌妇炎栓以甘肃省中医院院内制剂(甘药制字Z04000835)养阴生肌散处方为依据，通过提取工艺研究，溶媒筛选，基质配比研究及制剂工艺考察，研制出便利、高效的用于治疗宫颈炎、阴道炎等妇科疾病的养阴生肌妇炎栓剂［1］。

养阴生肌妇炎栓主要由黄柏、龙胆草、雄黄、青黛等药物组成，龙胆草作为处方中不可缺少的组成部分，具有清热燥湿，泻肝胆火的功效；龙胆苦苷性质稳定，为龙胆草的主要成分，因此，本研究采用高效液相色谱法对养阴生肌妇炎栓中龙胆草的有效成分龙胆苦苷进行含量测定［2-7］，现将结果报道如下：

1 仪器与试药

1.1 仪器 美国Waters高效液相色谱仪(包括：Waters 2487紫外检测器，Waters 1525自动进样器)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；电子分析天平(上海天平仪器厂)；超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；电热恒温水浴锅(上海医疗器械五厂)。

1.2 试药 养阴生肌妇炎栓(甘肃省中医院中药研究所制备)；龙胆苦苷对照品(中国药品生物制品检定所提供，批号：11070-200510)；甲醇、乙腈为色谱纯，水为重蒸水；其他试剂均为分析醇，实验所用药材由甘肃省中医院药学部提供。

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Shim-pack VP-ODS(150×4.6 mmI.D.)；流动相：水 - 乙腈(80∶20)；流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：10 μL；柱温：25.0℃；外标法。理论塔板数按龙胆苦苷标准品计算不得低于3 500。

2.1.2 对照品溶液制备 取在五氧化二磷减压干燥器中放置24小时的龙胆苦苷对照品适量，精密称定，用甲醇配制成浓度为0.8 mg/mL的对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液制备 取养阴生肌妇炎栓适量，加热溶解，精密称取约600 mg置50 mL烧杯中，加甲醇适量，超声10分钟，放冷至室温，过滤到25 mL的容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀。取8 mL移至25 mL容量瓶，加甲醇定容至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液备用。

2.2 结果

2.2.1 线性关系考察 精密称得龙胆苦苷对照品4.1 mg，配制浓度为0.41 mg/mL的对照品储备液，精密吸取对照品储备液 0.5、1.0、1.5、2.0、

2.5 mL置10 mL的容量瓶，用甲醇定容至刻度，依次进样10 μL，每组平行进3针，以峰面积为纵坐标，以浓度为横坐标进行回归。得回归方程为：Y=12 519X+238 59，r=0.999 8，线性范围为 20.0～110.0 μg/mL。表明在此浓度范围内线性关系良好。

2.2.2 精密度试验 精密吸取同一浓度龙胆苦苷对照品溶液(82 μg/mL)，重复进样7次，每次进样量 10 μL，以“2.1.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，以龙胆苦苷峰面积计算，RSD为2.17%(n=7)。结果表明，精密度较好。

2.2.3 专属性试验 分别取对照品溶液及样品溶液，按“2.1.1”项色谱条件操作，记录色谱图。结果供试品与对照品溶液均在相同保留时间出现吸收峰，阴性溶液无此峰，同时本试验条件下龙胆苦苷与其他组分分离完全。结果见图1。

图1 龙胆苦苷含量测定的HPLC色谱图

2.2.4 重现性试验 取同批养阴生肌妇炎栓，加热溶解、混匀，取6份，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，测定，记录色谱图，其RSD为0.98%，表明方法重现性良好。

2.2.5 回收率试验 采用加样回收法，取已知龙胆苦苷含量的同批养阴生肌妇炎栓，加热溶解、混匀，精密称取约600 mg，分别加入1、2、4 mL浓度为0.41 mg/mL的龙胆苦苷对照品溶液，各制备3份样品。按“2.1.3”项下相应方法制备供试品溶液，以“2.1.1”项下色谱条件测定，记录色谱图，计算回收率。结果显示平均回收率为98.10%，RSD为0.41%，见表1。

表1 养阴生肌妇炎栓中龙胆苦苷的回收率测定(n=3)

2.2.6 样品含量测定 取10批养阴生肌妇炎栓，加热溶解，混匀，取适量，精密称定，按“2.1.3”项方法制备供试品溶液，测定10批样品中龙胆苦苷的平均含量为1.62mg/g，RSD=2.57%，见表2。到处方中另外一味药的有效成分，而且两成分呈基线分离。因此，选取254 nm作为检测波长具有实际意义。3.2 流动相的选择 以龙胆苦苷为检测对象，通过调整流动相中乙腈与水的比例，以峰是否存在明显的拖尾、峰高，分离度和理论塔板数是否理想，基线是否平稳等作为评判标准，最终选取乙腈∶水(20∶80)为流动相。对于混合样品不能达到基线分离时，采用程序-时间处理方法，对基线进行回归。

表2 养阴生肌妇炎栓中龙胆苦苷的含量测定(n=3)

3 讨论

本研究测定的养阴生肌妇炎栓中龙胆苦苷的含量(1.62mg/g)，与《中华人民共和国药典》(2015年版一部)龙胆药材“含量测定”项下龙胆苦苷的含量(不得少于3.0%，即30.00 mg/g)相比，转移率较高，证明栓剂的制备过程中药材提取比较完全。

3.1 检测波长的选取 龙胆苦苷的最大吸收波长在274 nm处，当采用274 nm为检测波长时，检测灵敏度较高，但相应杂峰增多，基线不平稳，分离度较差；采用254 nm为检测波长时，基线平稳，分离度好。此外在254 nm处同一流动相下还可检测

［1］李喜香，刘效栓，张小华，等.养阴生肌散急性毒性及全身过敏性实验研究［J］.西部中医药，2014，27(1)：29-31.

［2］陈长勋，刘占文，孙峥嵘，等.龙胆苦苷抗炎药理作用研究［J］.中草药，2003，34(9)：814-816.

［3］王北婴，李仪奎.中药新药研制开发技术与方法［M］.上海：上海科学技术出版社，2001：788-808.

［4］赵瑞芝，梁伟杰，丘小惠.龙胆药材中龙胆苦苷的提取工艺研究［J］.中国药房，2005，16(12)：956-957.

［5］赵冰璐，姜连阁，刘亚芹.薄层扫描法测定龙胆中龙胆苦苷的含量［J］.中医药信息，2000，17(3)：69.

［6］陈二林，黄艳辉，刘效栓，等.养阴生肌散中龙胆苦苷的HPLC测定［J］.西部中医药，2013，26(10)：24-26.

［7］国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部［M］.北京：中国医药科技出版社，2015：96.

［8］赵昱玮，于淼，司学玲，等.炎热清片中龙胆苦苷的薄层鉴别及含量测定［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19(3)：118-120.