烟曲霉对人THP-1细胞中IL-6分泌和信号分子IκBɑ活化的影响

童建波 杜蕾蕾 曾 荣 王丽玮 刘宇甄 段志敏 陈 青 李 岷

由于广谱抗菌药物、糖皮质激素和免疫抑制剂的广泛使用，放疗、化疗、器官移植以及侵入性治疗措施的急剧增加，艾滋病等免疫缺陷性疾病的流行，侵袭性曲霉病的发病率在近年来快速上升[1]。据统计该病的致死率可高达50%～95%，而烟曲霉是最常见的致病菌[2]。宿主单核巨噬细胞作为固有免疫中重要反应细胞，能识别并清除入侵的烟曲霉[3]。本研究旨在探讨烟曲霉能否激活人急性单核细胞白血病细胞系细胞(THP-1)的信号分子NF-κB抑制蛋白(IκBɑ)，诱导白细胞介素6(IL-6)的分泌。

1 材料和方法

1.1 细胞、菌株、主要试剂 烟曲霉Af293(ATCC MYA-4609, CBS 101355)、人THP-1细胞株购自美国American Type Culture Collection(ATCC)。兔抗人IκBɑ和磷酸化IκBɑ抗体为美国Cell Signaling Technology公司产品。IL-6酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒为欣博盛公司产品。PrimeScript RT Master Mix逆转录酶试剂盒为日本TaKaRa公司产品。iTaq Universal SYBR Green Supermix为美国Bio-rad公司产品。巴豆酯(PMA)、β-葡聚糖(β-Glucan)、抑制剂BAY 11-7082为美国Sigma公司产品。

1.2 细胞培养 烟曲霉Af293在蛋白胨沙氏琼脂培养基(SDA)37℃培养3天收集烟曲霉孢子经56℃60 min水浴灭活后，配制成不同浓度菌悬液待用。人THP-l细胞用含10%胎牛血清、l%青链霉素的RPMI 1640培养基，于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养、传代。将细胞制备成105/mL细胞悬液，接种于12孔细胞培养板每孔1 mL及6孔细胞培养板每孔2 mL，加入100 g/L PMA刺激48 h后，予不同浓度烟曲霉共培养。

1.3 实时荧光定量逆转录PCR 终浓度为106CFU/mL和107CFU/mL烟曲霉与2×105/mL THP-1共孵育，并设阳性刺激物β-Glucan(100 g/L)组、培养基空白对照组、抑制剂BAY 11-7082组(10 μM BAY 11-7082预先与THP-1细胞共培养2 h)。TRIzol法抽提总RNA，按PrimeScript RTMaster Mix逆转录酶试剂盒说明书将1 μg总RNA反转录为cDNA。使用ABI 7300 PCR仪，采用Syber green法对目的基因进行扩增。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的变化水平，ΔCt=目的基因-内参照(β肌动蛋白)；某一样品的ΔΔCt=某一样品ΔCt-对照组样品的ΔCt。相关基因引物见表1。

1.4 Western印迹分析 烟曲霉悬液(107CFU/mL)作用的THP-1细胞，裂解细胞，提取总蛋白。等量蛋白的不同样品梯度SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电转至聚偏二氟乙烯膜上。5% BSA封闭2 h，兔抗人单克隆抗体4℃孵育过夜。TBST液洗膜3次后，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG第二抗体反应2 h，TBST液洗膜3次，Supersignal试剂显色发光，检测IκBα和磷酸化IκBα的水平。

1.5 ELISA法 刺激THP-l细胞后24 h，收集上清液，按照试剂盒说明书检测IL-6含量。

2 结果

2.1 烟曲霉对IL-6 mRNA水平的影响 刺激后1、3和6 h，不同浓度烟曲霉组、LPS组、空白对照组的IL-6 mRNA水平变化情况，见表2。107CFU/mL烟曲霉刺激THP-1细胞后3、6 h，IL-6 mRNA水平明显高于空白对照组(P<0.001)。107CFU/mL烟曲霉刺激THP-1细胞后1、3、6 h，IL-6 mRNA水平与空白对照组比较，P值分别为0.036、0.001、<0.001。

2.2 烟曲霉对IL-6蛋白分泌的影响 根据实时定量PCR结果，选取烟曲霉刺激效果较好的浓度107CFU/mL刺激后24 h，烟曲霉组、β-Glucan组、空白对照组的上清液中IL-6浓度的分别为(879.86±32.35)ng/L、(256.13±6.26)ng/L、(10.67±0.17)ng/L，烟曲霉组与空白对照组比较差异有统计学意义(均P<0.01)。

表1 实验所用引物序列

表2 烟曲霉对人THP-1细胞株IL-6 mRNA水平的影响

注：与空白对照组比较，aP<0.05；bP<0.001；cP<0.01

2.3 烟曲霉对THP-1细胞IκBɑ激活的影响 刺激后30 min，磷酸化IκBɑ蛋白水平已有升高，60 min时磷酸化IκBɑ蛋白水平显著升高；IκBɑ蛋白水平则相应有所降低。提示烟曲霉能够激活THP-1细胞信号分子IκBɑ。见图1。

1：空白对照组 2：作用15 min 3：作用30 min 4：作用60 min烟曲霉刺激后30 min即出现IκBɑ蛋白磷酸化，60 min时IκBɑ磷酸化水平显著升高，而对应的IκBɑ水平相应降低。

图1 烟曲霉体外作用THP-1细胞后不同时间IκBɑ和磷酸IκBɑ的水平

2.4 NF-κB信号通路抑制剂BAY 11-7082对烟曲霉上调THP-1细胞IL-6 mRNA水平的影响 10 μM BAY 11-7082预先与THP-1细胞共培养2 h后，再用107CFU/mL烟曲霉、β-葡聚糖刺激6 h IL-6 mRNA表达水平见表3。经统计分析，3组是否采用BAY 11-7082 IL-6mRNA表达水平差异有统计学意义(F=20.02，P<0.01，v=2)，抑制剂BAY 11-7082可阻断烟曲霉上调IL-6 mRNA水平。

表3 NF-κB信号通路抑制剂BAY 11-7082对烟曲霉上调THP-1细胞IL-6 mRNA 水平的影响

注：a：与空白对照组比较，P<0.001；b：与未用BAY 11-7082阻断组比较，P<0.001

3 讨论

固有免疫反应是抵抗真菌入侵的第一道防线，中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞作为主要的固有免疫细胞，在启动抗烟曲霉感染中发挥重要作用[4,5]。IL-6是炎症起始阶段的一个重要致炎因子，在天然免疫系统中分布广泛，它通过诱导多种细胞合成和分泌多种急性期蛋白，促进感染时中性粒细胞产生、活化，促进B细胞增殖、分化及产生免疫球蛋白，促进T细胞增殖、分化等，在急性期炎症反应中起重要作用。在真菌感染早期可诱导Th0细胞向Th17细胞分化，抵抗真菌感染[6,7]。在早期一项研究中发现，与正常小鼠相比，巨噬细胞游走抑制因子(MIF)基因敲除小鼠IL-6及IL-17水平显著下降，对烟曲霉的感染更为敏感，抗真菌感染的能力明显减弱[8]。THP-1细胞为来源于急性单核细胞白血病患者的细胞系，具有分化的潜能，可经佛波酯PMA诱导向巨噬细胞方向分化，细胞纯度高，取材方便，是体外研究炎症的良好细胞模型。THP-1细胞在正常培养时为悬浮状态，经过PMA刺激后，可以伸出伪足，吸附于细胞培养瓶中，成为贴壁状态，此过程在短时期内不可逆转。因此，选择类似于人体内单核-巨噬细胞系的THP-1细胞作为本实验的研究对象，可以在一定程度上模拟烟曲霉感染人体、侵犯机体固有免疫系统的过程。

本研究初步发现，106、107CFU/mL烟曲霉作用THP-1细胞后，上调IL-6 mRNA水平均出现时间依赖效应，在刺激后3 h出现上升，刺激后6 h，106CFU/mL烟曲霉组mRNA水平为3 h的6.8倍，107CFU/mL组则升高15.2倍。本研究采用β-Glucan作为激活THP-1细胞的阳性对照物，能诱导出相同的时间依赖效应，刺激6 h后IL-6 mRNA水平比3 h组上升7.7倍。刺激后3 h，106CFU/mL组IL-6 mRNA水平为8.27±0.29，107CFU/mL组为13.79±0.62，后者为前者的1.6倍。刺激后6 h，两组分别为56.86±11.25和209.38±25.35，高浓度烟曲霉组为低浓度组的3.7倍，提示烟曲霉上调IL-6 mRNA水平为剂量依赖效应。本研究结果表明，107CFU/mL作用THP-1细胞24 h后，上清液中IL-6含量为(879.86±32.35)pg/mL，与空白对照组(10.67±0.17 pg/mL)比较，明显上升，表明烟曲霉能在mRNA水平诱导THP-1细胞上调IL-6转录，在蛋白水平增强该因子的分泌。

NF-κB作为一种转录因子在调控前炎症因子转录表达中起重要作用，NF-κB家族蛋白包括p50/p105、p52/p100、p65/RelA、RelB及c-Rel。通常NF-κB以二聚体形式存在，静息状态下，与NF-κB 抑制蛋白(inhibitor proteins of NF-κB，IκB)结合，并以无活性形式存在于胞质中；当细胞接受适宜刺激后，IκB在IKB激酶(IκB kinase，IKK)诱导下发生磷酸化。IκB即发生多泛素化反应，再被蛋白酶体降解，激活NF-κB。活化的NF-κB暴露出核定位序列，从而进入核内与脱氧核糖核酸特定位点结合，启动基因转录，产生并释放细胞因子[9,10]。而IκBɑ磷酸化抑制剂Bay 11-7082可抑制NF-κB活化的几乎所有环节，包括IκBɑ磷酸化和降解、p65磷酸化及p50、p65和c-Rel核转移[11]。本实验结果表明，烟曲霉刺激后30 min即出现IκBɑ蛋白磷酸化，60 min时IκBɑ磷酸化水平显著升高，而对应的IκBɑ水平相应降低。

我们进一步通过NF-κB抑制剂Bay 11-7082阻断信号通路，即用10 μM BAY 11-7082预先与THP-1细胞共培养后，再用107CFU/mL烟曲霉刺激，可以观察到IL-6 mRNA 表达水平(2.19±0.62)较未用BAY 11-7082组(206.18±20.43)明显减低，BAY 11-7082可阻断烟曲霉上调 IL-6 mRNA水平。提示烟曲霉可诱导THP-1细胞中作为NF-κB二聚体抑制剂的IκBɑ分子出现活化，其对NF-κB抑制效应随之降低，最终导致NF-κB活化入核，调节IL-6等前炎症因子的转录表达。

烟曲霉对人THP-1 细胞刺激后可出现IκBɑ蛋白磷酸化，IL-6在 mRNA 水平、蛋白水平表达量升高，并且在一定程度内呈现剂量依赖性、时间依赖性。表明人THP-1细胞体外与烟曲霉共培养后激活信号分子IκBɑ并分泌IL-6，参与抗烟曲霉感染固有免疫反应。因此，可能为今后的临床治疗提供新的治疗靶点和理论基础。

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