共培养体系对哺乳动物卵母细胞体外成熟影响的研究进展

张 俊，石德顺，陆凤花

（广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530000）

20 世纪80 年代后期，为了尽可能模拟体内细胞培养的微环境，人们在细胞培养技术的基础上衍生出细胞共培养技术。细胞共培养是指将2 种或2 种以上细胞共同培养于同一环境中，包括直接共培养和间接共培养，由于共培养体系与体内环境较吻合，便于细胞之间相互信息交流沟通，具有相互支撑生长增殖等优点，因此被广泛应用于现代细胞培养研究中。哺乳动物卵母体外成熟一直是研究卵母细胞体外培养、体外受精和胚胎发育等关键步骤，也一直是研究热点和难点。与卵母细胞体内成熟相比，卵母细胞体外成熟存在细胞核和细胞质成熟不协调、不同步问题，这直接导致卵子发育潜力受阻，表现为体外受精胚胎发育率低和胚胎质量差等。哺乳动物卵母细胞体外成熟质量差与卵母细胞体外成熟培养体系不完善有密切关系，因此，致力于卵母细胞体外成熟培养体系的完善，尽可能模拟卵母细胞体内成熟环境，一直是研究卵母细胞体外成熟的重要内容。在体内卵母细胞的成熟是与卵泡细胞共培养的环境，而细胞共培养技术具有利用细胞的代谢产物和促进胚胎早期发育的作用。因此，为了提高哺乳动物卵母细胞体外成熟的效果，近年来关于哺乳动物卵母细胞体外成熟与多种细胞共培养的研究有诸多报道。本文主要从卵母细胞体外成熟与卵泡细胞共培养、与裸卵共培养和与间充质干细胞培养3 个方面综述共培养体系对哺乳动物卵母细胞体外成熟的作用，为共培养体系用于大家畜甚至人卵母细胞体外成熟奠定基础。

1 卵泡细胞共培养对哺乳卵母细胞体外成熟的影响

卵母细胞在体内成熟时，外部主要被卵泡细胞包围，这些卵泡细胞包括颗粒细胞、卵丘细胞和卵泡内膜细胞，三者在卵母细胞体内成熟中不仅具有物理的立体支撑作用，而且能分泌卵母细胞体内成熟所需要的一些细胞因子和生长因子，如次黄嘌呤、cAMP 等，相关细胞因子在维持卵母细胞成熟阻滞中起到至关重要作用。因此，为了最大限度模拟卵母细胞体内成熟的环境，有关卵泡细胞与卵母细胞成熟共培养的研究越来越多。

目前，卵泡细胞共培养用于哺乳动物卵母细胞体外成熟的研究主要集中在绵羊、猪等家畜和人上。Adeldust 等[1]研究了绵羊卵母细胞体外成熟与颗粒细胞共培养，发现颗粒细胞共培养可明显提高绵羊卵母细胞发育至MII 期比率和卵裂率。猪卵母细胞体外成熟时，适宜细胞密度的卵丘细胞与猪卵母细胞成熟共培养，能提高体外受精（IVF）和孤雌激活（PA）胚胎的发育潜力，原因是共培养体系可改变卵母细胞特定基因的表达，提高细胞内谷胱甘肽含量，从而提高卵母细胞体外成熟效率[2]。在猪卵母细胞冷冻研究中发现，冷冻复苏后未成熟卵母细胞与猪颗粒细胞共培养后能增强细胞核和细胞质成熟效果，明显提高体外受精和卵胞浆单精子显微注射（ICSI）胚胎发育能力[3]。也有研究发现，使用犬卵丘细胞和输卵管与猪卵母细胞成熟共培养，可创造适宜卵母细胞成熟的微环境，显著降低卵母细胞凋亡水平和细胞内活性氧水平，增强卵母细胞成熟效果进而提高PA 胚胎发育潜力[4]。石德顺等[5]在牛卵泡内膜细胞的系统研究中发现，内膜细胞及其条件液均能提高牛卵母细胞体外成熟率、受精卵裂率和囊胚率。研究共培养体系提高人卵母细胞体外成熟效率，这对临床辅助生殖技术具有重要意义。Jahromi 等[6]研究指出，人颗粒细胞与卵母细胞共培养可显著提高ISCI 胚胎发育速度、发育质量和囊胚率，但对受精率没有显著影响。使用同一个体人成熟卵母细胞的卵丘细胞与未成熟卵母细胞共培养，发现共培养体系可在一定程度为卵母细胞成熟提供卵泡微环境，进而影响胚胎发育、表观遗传和细胞周期等相关基因表达，从而提高卵母细胞成熟率，甚至可达到卵母细胞体内成熟相似水平[7]。截止目前，关于哺乳动物卵母细胞成熟与卵泡细胞共培养的研究相对较多，但大多数共培养体系集中于颗粒细胞和卵丘细胞，而且都是使用本物种来源细胞与卵母细胞成熟共培养。对于卵泡细胞共培养影响卵母细胞体外成熟的具体机理研究相对较少，且不够系统和深入，有待进一步研究。

2 裸卵共培养对哺乳卵母细胞体外成熟的影响

卵母细胞成熟时卵母细胞和卵泡细胞之间相互影响，因此，在研究卵泡细胞共培养旁分泌作用对卵母细胞成熟影响同时，也应更关注卵母细胞自分泌作用对卵母细胞成熟的影响，有关裸卵共培养的研究主要集中在猪、牛和水牛上。裸卵共培养是指在卵母细胞体外成熟时，使用没有卵丘细胞包裹的未成熟卵母细胞与卵丘卵母细胞复合体一起培养的方式，研究卵母细胞自身分泌母源性因子对卵母细胞体外成熟的作用。

Morselli 等[8]研究发现，家猫裸卵在3D 培养系统与家猫卵母细胞共培养能提高卵母细胞减数分裂能力和后续胚胎发育潜力，这可能与裸卵能分泌的一些相关因子（母源性因子）影响卵母细胞成熟有关。猪卵母细胞体外成熟与裸卵共培养研究发现，适宜裸卵与卵母细胞比例（9:16）共培养可提高猪卵母细胞成熟卵丘扩展和维持减数分裂阻滞，这可能是卵母细胞分泌因子和卵母细胞卵丘细胞之间缝隙连接所引起[9]。但Appeltant 等[10]研究表明，不论猪裸卵和卵母细胞比例如何，裸卵共培养不能提高猪卵母细胞成熟效果、受精率和胚胎发育。也有研究表明，猪形态较好卵母细胞与较差卵母细胞共培养，可显著提高形态较差卵母细胞成熟效果和胚胎发育能力，从而提高猪形态较差卵母细胞的利用率[11]。牛卵母细胞成熟与裸卵共培养时，共培养体系能提高牛体细胞核移植（SCNT）胚胎发育能力和胚胎质量，基本达到IVF 胚胎发育水平[12]。同时，牛卵母细胞成熟与裸卵共培养，显著提高核移植胚胎发育能力和质量，且共培养组胚胎发育相关基因甲基化和乙酰化水平与IVF 组胚胎相当[13]。水牛卵母细胞成熟与裸卵共培养研究发现，水牛裸卵共培养卵母细胞分泌因子能提高水牛卵丘细胞凋亡水平和激活细胞cAMP 产生，但对类固醇生成没有影响，这可能是卵母细胞分泌因子影响卵丘细胞糖酵解和缝隙连接所致[14]。卵丘细胞与裸卵共培养可显著提高裸卵发育潜力（卵裂率、囊胚率），这可能与二者共培养影响卵母细胞凋亡、改变细胞内cAMP和MPF 活力以及管控合子基因影响受精率进而影响卵母细胞成熟有关[15]。目前卵母细胞成熟与裸卵共培养的研究很少，且在哺乳动物卵母细胞进行体外成熟时一般认为出现裸卵是由于操作人员技术所导致，因而忽略了裸卵所起到的作用。上述研究表明，适当比例的裸卵与卵母细胞共培养可促进卵母细胞体外成熟，但是裸卵具体影响卵母细胞成熟时卵丘的扩展、卵丘与卵母细胞间缝隙连接还是卵母细胞本身成熟，目前有待具体进行研究。

3 间充质干细胞共培养影响哺乳卵母细胞体外成熟

卵母细胞体内成熟时主要被卵泡细胞包裹，因而上述共培养体系均建立在模拟卵母细胞成熟的体内环境基础上，但不止卵泡细胞共培养能提高卵母细胞体外成熟效果，其他来源细胞与卵母细胞成熟共培养也可提高卵母细胞体外成熟效率，如间充质干细胞。间充质干细胞具有免疫特性，分泌多种生物活性物质如细胞因子和生长因子（MCP-1、VEGF-A、EGF、FGF-2、IL-6、LIF和TGFβ等），而有些生物活性物质可提高卵母细胞减数分裂能力、卵母细胞成熟和胚胎发育潜能。Ling 等[16]在小鼠卵母细胞成熟液中添加小鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）的培养基中共培养，发现BMSC 条件液可促进小鼠腔前卵泡发育，提高卵母细胞减数分裂能力、激素产生和皮质颗粒分布等，因此，BMSC 共培养明显提高小鼠腔前卵泡发育、卵母细胞成熟和胚胎发育潜力。猪卵母细胞成熟共培养的研究表明，人脂肪间充质干细胞（ADSC）与猪卵母成熟共培养，能显著提高猪卵母细胞成熟效果和胚胎发育能力，同时年轻供者来源ADSC 的共培养成熟效果较年老供者来源ADSC 显著提高[17]。间充质干细胞在人上的研究相对很多，目前主要集中于研究间充质干细胞用于细胞治疗、组织工程和器官移植等方面。间充质干细胞用于疤痕修复和卵巢早衰研究中，也采用间充质干细胞共培养的方式利用间充质干细胞可分泌某些生物活性因子从而发挥作用。但目前使用人间充质干细胞共培养，用于人卵母细胞体外成熟的研究尚未见报道。

4 间充质干细胞共培养影响哺乳动物腔前卵泡发育

卵母细胞成熟与卵泡发育密切相关，卵泡发育是指卵泡由原始卵泡发育成为初级卵泡、次级卵泡、三级卵泡和成熟卵泡的生理过程，在卵泡发育过程中，卵泡内膜细胞分布有许多血管，参与雌激素的合成。同时，颗粒细胞和内膜细胞分泌一些生长因子、细胞因子等，共同调控卵泡的发育。

研究哺乳动物腔前卵泡体外培养，可为哺乳动物提供更丰富卵母细胞来源。有研究表明，使用人骨髓间充质干细胞与人腔前卵泡共培养，可为腔前卵泡提供合适的发育微环境，并显著提高卵泡存活率、生长速度和生存能力；深入研究发现，共培养体系可显著上调卵泡发育中卵母细胞GDF9、BMP15表达，颗粒细胞inhibitβA、TGFβ1表达[18]。Rajabi 等[19]研究人月经血间充质干细胞与小鼠腔前卵泡在3D 系统共培养，发现共培养体系可提高小鼠腔前卵泡生长成熟和IVF 胚胎发育潜力，包括卵泡存活率、卵泡腔的形成、雌二醇和孕酮激素水平，同时上调GDF9和BMP15表达，下调Mater表达。最新研究表明，小鼠腔前卵泡在3D 系统与小鼠ADSC 共培养，可显著提高小鼠腔前卵泡存活、生长发育和减数分裂能力，这为研究人自体ADSC 用于人腔前卵泡共培养提供理论依据[20]。小鼠卵巢内皮细胞与小鼠卵泡发育共培养的研究发现，被激活卵巢内皮细胞共培养可提高早期卵泡的发育和存活能力，这为研究早期卵泡发育成熟以及内皮细胞与卵泡之间联系提供良好平台[21]。间充质干细胞共培养促进哺乳动物腔前卵泡发育的相关研究，从卵泡发育的角度间接说明了共培养体系起到促进哺乳动物卵母细胞体外成熟的作用。

5 展 望

哺乳动物卵母细胞的体外成熟一直是制约胚胎工程技术发展的难点，也一直是研究的热点。目前，哺乳动物卵母细胞体外成熟虽然已经进行大量系统的研究，但卵母细胞体外成熟效果与体内相比仍然不理想，因此，从细胞共培养体系的角度出发，在体外尽可能模拟体内卵母细胞成熟的微环境，是目前体外培养卵母细胞成熟的有效方法，且共培养体系可用同种或异种动物细胞与卵母细胞共培养，共培养细胞不止局限于颗粒细胞、内膜细胞，也包括间充质干细胞等。但目前共培养体系对哺乳动物卵母细胞体外成熟作用的具体机理不清楚，无法在体外对共培养体系进行精细调控以进一步提高卵母细胞的体外成熟效率。随着共培养体系的研究越来越深入和系统，共培养体系的作用机制越来越明晰，共培养体系提高卵母细胞体外成熟效率会更加精准，共培养体系可广泛应用于哺乳动物卵母细胞的体外成熟培养，甚至人卵母细胞体外成熟培养中。