SIRT1在非酒精性脂肪肝病大鼠肝脏中的表达及姜黄素衍生物L6H4的干预作用

丁婷婷，吴杭菲，刘成，汤雯，王圣凯，郑靖宇，朱再胜，彭天庆

（温州医科大学附属第一医院，浙江 温州 325015，1.病理科；2.老年病科）

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外乙醇和其他明确的损肝因素所致的以肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征[1]。研究表明氧化应激与脂质过氧化是导致NAFLD发生、发展的重要机制之一[2-3]。沉默调节蛋白1（silent information regulater 1，SIRT1）是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依赖的蛋白去乙酰化酶。REN等[4]研究发现，SIRT1可通过减少脂肪酸及甘油三酯（triglycer-ide，TG）产生、调节脂质稳态及抵抗氧化应激而在NAFLD中发挥重要作用。L6H4是去除了姜黄素β-二酮基团的姜黄素衍生物，具有更好的稳定性，已被证实具有强大的抗炎、抗氧化等广泛的药理作用。目前，已有研究表明姜黄素能够明显阻碍NAFLD的进展，但关于姜黄素衍生物L6H4防治NAFLD的研究却少有报道。本研究通过高脂诱导NAFLD大鼠模型，用姜黄素衍生物L6H4进行干预，观察大鼠血脂、肝脏氧化应激水平和形态学改变，并检测SIRT1、发动相关蛋白1（mitochondrial dynamin-related protein1，DRP 1）和线粒体融合蛋白2（mito fusion 2，MFN2）在大鼠肝脏组织中的表达，探讨姜黄素衍生物L6H4对NAFLD发挥保护作用的可能机制，为NAFLD的防治提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 动物模型建立与处理 选用12周龄、体质量为（280±20）g的雄性SD大鼠（由温州医科大学实验动物中心提供，动物使用许可号：WYDW2014-0052）。适应性喂养1周后，随机分为3组，正常组（control组）、模型组（NAFLD组）和治疗组（L6H4组），每组8只。control组给予基础饲料，余2组全程给予高脂饲料（上海普路腾生物科技有限公司），配方及营养素占比见表1-2。L6H4组并从第9周开始用姜黄素衍生物L6H4干预治疗。具体方法：于每天下午1∶00-2∶00按实验设计给予L6H4组0.2 mg・kg-1姜黄素衍生物L6H4溶于1%的羧甲基纤维素钠（sodium carboxymethyl cellulose，CMC）灌胃，control组和NAFLD组给予相应体积的1% CMC灌胃。至20周末禁食12 h后，用腹腔注射水合氯醛处死各组大鼠。分别收集全血及取部分肝组织置4%中性甲醛溶液中固定，用于肝组织形态学观测；另取部分肝组织置-80 ℃冰箱迅速冷冻备用。

表1 高脂饲料配方（g/100 g）

表2 各营养素占比（%）

1.2 药品与主要试剂 姜黄素衍生物L6H4（温州医科大学梁广教授惠赠）；蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物公司）；蛋白一抗（美国CST公司）；蛋白二抗（美国Bioword公司）；ECL发光液（杭州弗德生物科技公司）；Trizol、PCR引物合成（美国Invitrogen公司）；反转录试剂盒（大连Takara公司）；RT-PCR试剂盒（美国ABI公司）；超氧化物歧化酶（super oxide dismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）测定试剂盒（南京建成生物公司）。

1.3 方法

1.3.1 血脂的检测：大鼠麻醉后断头取全血，全自动生化分析仪检测各组大鼠的TG、总胆固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白胆固醇（lowdensity lipoprotein cholesterol，LDL-C），高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）水平。

1.3.2 光镜标本制作：取4%中性甲醛溶液固定24 h肝组织，按常规行乙醇梯度脱水、石蜡包埋后，切片（厚度为5 μm），分别用于常规HE染色和Masson染色[5]，光镜下观察肝组织的病理变化情况。

1.3.3 肝组织中MDA含量及T-SOD活力检测：分别称取各组大鼠肝组织，每只15 mg，分别放入已加裂解液的Ep管中，冰上匀浆，置4 ℃离心（13000 r/min，15 min），取上清液，BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，检测各组肝脏组织内MDA含量及T-SOD活力，具体操作按试剂盒说明书进行，并重复3次。

1.3.4 RT-PCR检测：分别称取各组大鼠肝组织，每只20 mg，分别放入已加1 mL Trizol的预冷去酶Ep管中，按Trizon试剂说明书方法提取总RNA。以总RNA为模板反转录合成cDNA，取适量cDNA以10 μL体系放入PCR仪进行反应。结果以β-actin为内参照，根据循环（Ct）值用2-△△Ct法计算基因的相对表达量。SIRT1引物序列上游：5’-CGGACAGTTCCAGCC ATCTC-3’，下游引物：5’-CAAAGGAACCATGACACTGAATG-3’；DRP1引物序列上游：5’-GAAGTGGTGCAGTGGAAATG AC-3’，下游引物：5’-GTTTCTATTGGGAACCACTGCC-3’；MFN2引物序列上游：5’-CACTACCACATCGGACACCCTA-3’，下游引物：5’-GAACTTGTGTCTTGCATTTGGC-3’；β-actin引物序列上游：5’-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3’，下游引物：5’-ATACTCCTGCTTGCTGATCC-3’，实验重复3次。

1.3.5 Western blot检测：如1.3.3处理肝组织，测定蛋白浓度，定容定量后取样品加热变性，加样，电泳分离蛋白，转膜，5%脱脂牛奶封闭，TRS-T洗膜后4 ℃下一抗摇床过夜，洗膜后 II抗室温孵育1 h，再次洗膜后加化学发光液，用Image-lab成像仪曝光显影。用计算机分析软件对条带进行分析，以目的蛋白与内参条带积累吸光度（A）比作为反映目的蛋白表达的相对指标。一抗浓度：各蛋白指标1∶1000；内参1∶5000； II抗浓度1∶5000，实验重复3次。

1.4 统计学处理方法 运用SPSS19.0统计软件进行数据分析。计量资料均采用±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐者组间两两比较采用LSD法。方差不齐者则用Tamhane’s T2法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血脂的比较 与control组比，NAFLD组大鼠血清中TG、TC和LDL-C浓度均显著升高，而HDL-C浓度显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与NAFLD组比，L6H4组大鼠血清中TG、TC和LDL-C的浓度较均显著降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠血脂水平比较（n=8，±s，mmol/L）

表3 各组大鼠血脂水平比较（n=8，±s，mmol/L）

与control组比：aP＜0.05，bP＜0.01；与NAFLD组比：cP＜0.05，dP＜0.01

2.2 肝脏形态学变化 肝组织HE染色显示：control组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞呈多面体形，胞浆丰富，胞核居中，以中央静脉为中心，肝细胞呈单行条索状向周围呈放射状排列，肝索间可见明显的肝窦；NAFLD组肝小叶结构明显紊乱，大量肝细胞脂肪变性，显示细胞体积增大，胞浆内可见大小不等的空泡，胞核偏离或靠近胞膜，肝窦消失，肝小叶内可见局灶性坏死及炎症细胞浸润；L6H4组肝小叶结构较紊乱，部分肝细胞脂肪变性，胞浆内可见小空泡，大部分胞核居中，小叶内未见明显的坏死及炎症细胞浸润，可见L6H4组脂肪变性较NAFLD组明显减轻。见图1A-C。肝组织Masson染色显示：control组大鼠肝组织汇管区、肝被膜及中央静脉周围可见很少量的胶原纤维呈蓝色；NAFLD组大鼠肝组织汇管区及中央静脉周围见明显胶原纤维增多并向周围放射，未见假小叶形成；而L6H4组大鼠肝组织汇管区及中央静脉胶原纤维明显减少，见图1D-F。

2.3 各组大鼠肝组织T-SOD活力及MDA含量测定结果 与control比，NAFLD组大鼠肝组织T-SOD活力明显降低，而脂质过氧化标志物MDA含量升高，差异均具有统计学意义（P＜0.05）；与NAFLD组相比，L6H4组大鼠肝组织T-SOD活力明显升高，而MDA含量明显下降，差异均具有统计学意义（P＜0.05），表明姜黄素衍生物L6H4具有抗氧化性，见图2。

图1 各组大鼠肝组织HE染色及Masson染色

图2 各组大鼠肝组织SOD活力及MDA含量测定结果

2.4 各组大鼠肝组织SIRT1、DRP1、MFN2的mRNA表达 与control组比，NAFLD组大鼠肝脏组织DRP1 mRNA表达量明显升高，而SIRT1及MFN2 mRNA表达量明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与NAFLD组比，L6H4大鼠DRP1 mRNA表达量明显降低，SIRT1及MFN2 mRNA表达量明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.01），见图3。

2.5 各组大鼠肝组织SIRT1、DRP1、MFN2的蛋白表达 与control组比，NAFLD组大鼠肝脏组织DRP1蛋白表达量明显升高，而SIRT1及MFN2蛋白表达量明显降低，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与NAFLD组相比，L6H4组大鼠DRP1蛋白表达量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.01），而SIRT1及MFN2蛋白表达量明显升高，差异均有统计学意义（P＜0.05），见图4。

3 讨论

图3 各组大鼠肝组织mRNA表达结果

目前NAFLD的发病机制尚未明确，但以“二次打击”学说为基础的“多重打击”理论被大多数的学者所接受[6]。近年来，研究发现SIRT1通过调节肝细胞的脂质和碳水化合物的代谢在NAFLD的发生、发展中发挥重要的作用[7]，高脂饮食可降低肝组织中SIRT1的表达，减少肝细胞中脂肪酸氧化，从而增加脂肪生成和细胞内的沉积[8]，而过表达SIRT1则能够延缓NAFLD的进展[9]。本研究结果显示NAFLD模型肝组织内SIRT1的表达量明显降低，而且外周血中TG和LDL-C升高、HDL-C降低。此结果与TOBITA等[8]的研究结果类似。COLAK等[9]认为SIRT1可降低肝细胞的胰岛素抵抗，改善肝细胞的脂质代谢，从而减少脂肪生成和细胞内的沉积。姜黄素衍生物L6H4干预治疗后，NAFLD大鼠肝组织内SIRT1的表达量明显升高，肝组织的脂肪变性和胶原纤维的沉积明显改善，同时外周血中HDL-C增高，TG和LDL-C降低。表明姜黄素衍生物L6H4改善肝细胞的脂质代谢，减轻肝细胞的脂肪变性。其机制与可能其上调NAFLD大鼠肝组织内SIRT1的表达，从而降低肝细胞对胰岛素的抵抗，改善肝细胞的脂质代谢有关。

图4 各组大鼠肝组织蛋白表达结果

SOD和MDA是公认的监测氧化应激的生物标志。SOD活力减弱，MDA含量增加提示氧化应激增强。在NAFLD发展过程中，氧化应激损伤被认为是重要的病理生理基础[10]。本研究结果表明姜黄素衍生物L6H4能降低NAFLD模型大鼠肝脏的氧化应激损伤。最近的研究表明，在高脂诱导的NAFLD模型中，SIRT1可提高SOD的表达及活性，从而抵抗氧化应激损伤[11]。本研究发现姜黄素衍生物L6H4不仅增加肝组织SIRT1的表达和SOD活性，而且降低肝组织内脂质过氧化的最终产物MDA含量，减少MDA对细胞的毒性作用。提示姜黄素衍生物L6H4具有“双重”抗氧化应激的作用。其机制可能是姜黄素衍生物L6H4提高NAFLD模型大鼠肝细胞中的SIRT1的表达，一方面通过脱乙酰基活化，提高SOD的表达及活性；另一方面通过减少肝细胞脂质的沉积，降低脂质过氧化产生的MDA。

近年来氧化应激与线粒体功能的关系受到普遍关注，线粒体的功能与其结构密切相关，而线粒体的结构是由线粒体的融合及分裂的平衡来维持的。在哺乳动物中DRP1是线粒体分裂的重要执行分子，而MFN2是线粒体融合的主要执行分子，两者的作用平衡是保证线粒体功能的关键[12]。在病理状态下，ROS主要产生于线粒体，ROS增多，线粒体分裂增加，引起线粒体凋亡的发生[13]。我们前期的体外实验发现：棕榈酸使肝细胞DRP1表达增加，MFN2表达减少；姜黄素衍生物L6H4干预后则明显减少棕榈酸环境中肝细胞的DRP1的表达，从而抑制线粒体的分裂及其下游线粒体凋亡途径的信号传导[14]。近期研究表明，SIRT1参与调控了多种与线粒体增殖的转录因子的表达及活性，从而对线粒体数量及质量调节起重要作用[15-18]。本研究检测了SIRT1、DRP1和MFN2 mRNA及蛋白的表达水平，发现姜黄素衍生物L6H4能明显提高高脂诱导NAFLD模型大鼠肝组织内SIRT1、MFN2表达水平，降低DRP1表达水平。表明姜黄素衍生物L6H4可能通过调节或激活SIRT1的表达和活性，促进线粒体融合，同时抑制线粒体分裂，进而发挥其对NAFLD的保护作用，但其机制有待进一步研究证实。

综上所述，姜黄素衍生物L6H4可显著改善NAFLD的进展，其机制可能是通过增加SIRT1的表达和活性，降低肝细胞对胰岛素的抵抗和脂质过氧化反应，减轻氧化应激、抑制线粒体分裂。代谢调节因子SIRT1可能作为NAFLD潜在的药物治疗靶点。

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