人YAP1基因亚型的质粒构建及表达鉴定

董晶莱，张金三，郭强，陈千杰，郭丽莎，李校堃

（温州医科大学 药学院，浙江 温州 325035）

胰腺癌是一类恶性程度高，预后差，生存率低的肿瘤[1-2]。胰腺癌细胞往往存在KRAS突变，而YAP1（Yes-associate protein 1）是突变KRAS下游重要的效应蛋白，参与肿瘤癌变进程[3]，有望成为治疗胰腺癌的新靶点。YAP1是Hippo信号通路下游重要蛋白之一，在调控器官大小，细胞接触抑制、增殖、肿瘤的形成等发面有重要作用[4-7]。YAP1有8个亚型，根据WW域的个数分一型和二型，含有1个WW域的为YAP1-1，含有2个的为YAP1-2。根据其转录激活结构域（transcriptional activation domain，TAD）是否插入片段，又分为YAP1-1α、β、γ、δ和YAP1-2α、β、γ、δ[8-10]。迄今为止，还未见相关YAP1各亚型的研究报道。本研究构建了pCI2-Flag-YAP1-1δ和2δ两个亚型，为后续研究各亚型间的区别奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 DH5α感受态细胞购自北京全式金公司，JM110感受态细胞购自上海唯地公司，HEK293人肾上皮细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心，Faststart high fidelity PCR System购自美国Roche公司，DNA回收试剂盒、质粒小提试剂盒购自北京TIANGEN公司，ClaI限制性内切酶、SalI限制性内切酶购自美国NEB公司，T4连接酶购自美国Promega公司，lipo2000购自美国Invitrogen公司，Opti-MEM、FBS、DMEM购自美国Gibco公司，考马斯亮蓝购自北京LEAGENE公司，Tris-HCl缓冲液购自北京Solarbio公司，5×Dual Color Protein Loading Buffer购自杭州弗德生物公司，PVDF膜购自美国BIO-RAD公司，YAP（D8H1X）一抗购自美国CST公司，β-actin Mouse mAb购自美国Sigma公司，兔二抗、鼠二抗购自安徽Biosharp公司，pCI2-Flag-YAP1-2γ质粒由本实验室前期构建，PCR仪、电泳仪、曝光仪购自美国BIO-RAD公司，酶标仪购自美国Molecular Devices公司。

1.2 方法

1.2.1 质粒的扩增：由于后面实验涉及到ClaI位点的酶切，且ClaI基因序列在DH5α感受态细胞中扩增时，酶切位点会被甲基化，从而影响限制性内切酶的酶切，所以需要重新将pCI2-Flag-YAP1-2γ质粒用JM110感受态细胞进行转化。将质粒与JM110感受态细胞均匀混合，冰上孵育30 min，于37 ℃水浴热激2 min，迅速拿出置于冰上2 min，再加500 μL的LB培养基于37 ℃的恒温摇床孵育1 h，转速150 r/min。取少量菌液于带AMP抗性的LB培养基中摇菌，37 ℃，150 r/min，12 h。用碱裂解法提取质粒备用。

1.2.2 pCI2-Flag-YAP1-2δ重组质粒的构建：PCR和酶切：pCI2-Flag-YAP1-2δ比pCI2-Flag-YAP1-2γ在结构上多了12个碱基（YAP1，Gene ID：10413），利用重叠PCR添加碱基的方法，进行两步扩增。设计引物P1：5’-CGGAATTCATCGATCAGACAACAACATG-3’；P2：5’-ATAAGAATGCGGCCGCGTCGACTATAACCATGTAAGAAAGC TTTC-3’；P3：5’-CTTCGGCAGGTGAGGCCACAGGCAATGCGG AATATCAATCCCAGCA-3’；P4：5’-TCCGCATTGCCTGTGGCC TCACCTGCCGAAGCAGTTCTTGCTG-3’。以pCI2-Flag-YAP1-2γ为模板，用P1、P4和P2、P3这两对引物分别进行PCR扩增，条件为95 ℃预变性2 min，95 ℃20 s，58 ℃ 45 s，68 ℃ 1 min，共29个循环，最后72 ℃ 2 min，冷却至4 ℃。通过DNA琼脂糖凝胶判断DNA片段是否正确，分别纯化回收DNA片段，得到F1、F2两个片段。取等量的F1和F2作为双模板，选P1和P2为引物进行第二次PCR扩增，将所得到的扩增产物进行DNA琼脂糖凝胶电泳分析，确定正确后纯化回收，得到所需片段F3，大小为980 bp。选取ClaI和SalI两个限制性内切酶分别对pCI2-Flag-YAP1-2γ质粒和F3片段进行酶切，选取buffer3.1，室温下过夜酶切。对酶切的pCI2-Flag-YAP1-2γ质粒进行胶回收，切取4500 bp左右的质粒骨架，包括pCI2骨架结构以及YAP1的前576个碱基。对F3片段进行酶切体系回收。

连接与转化：将酶切回收的pCI2骨架片段和F3片段用T4连接酶进行快速连接，37 ℃水浴锅连接2 h。连接产物用DH5α进行转化，冰浴30 min，37 ℃热激2 min，再加500 μL的LB培养基于37 ℃的恒温摇床孵育1 h，转速150 r/min。将菌液均匀涂布于带AMP抗性的LB固体培养基，倒置于37 ℃恒温箱培养12 h。

质粒小提：挑取多个单克隆的菌落，置于5 mL的带AMP抗性的LB液体培养基内，于恒温摇床摇菌12 h，条件为37 ℃，150 r/min。将菌液离心，弃掉培养基，重悬，用碱裂解法裂解细菌，酸中和，可见白色絮状沉淀，离心收集上清液，过柱纯化，洗脱得到质粒。

1.2.3 重组质粒的鉴定：对重组质粒pCI2-Flag-YAP1-2δ分别进行酶切及基因测序鉴定。选取EcoRI和SalI限制性内切酶对提取的重组质粒进行双酶切鉴定，进行1%的琼脂糖凝胶电泳，根据酶切片段大小验证重组质粒是否构建成功；同时也对提取的重组质粒进行基因测序的鉴定，由于YAP1序列在1500 bp左右，相对较长，设计3条引物进行测序，①5′测序引物及序列CMV-F：5’-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3’；②YAP1-ClaI 5’：5’-AATCACATCGATCAGACAACAACATG-3’；③3′测序引物及序列YAP1-SalI-3’：5’-GAGGTCGAC TATAACCATGTAAGAAAGCTTTC-3’。

1.2.4 pCI2-Flag-YAP1-1δ重组质粒的构建：以鉴定正确的pCI2-Flag-YAP1-2δ重组质粒为模板，利用重叠PCR的方法删去WW域的基因序列得到1δ基因片段。设计引物P5：5’-TTCTCTGGTTCATGGCTGAAGCCG AGTTCATC-3’；P6：5’-GATGAACTCGGCTTCAGCCATGAA CCAGAGAA-3’。以pCI2-YAP1-2δ为模板，分别用P1、P5和P2、P6进行PCR扩增，条件同2δ的片段扩增。通过DNA琼脂糖凝胶判断得到135 bp和763 bp的基因片段，分别纯化回收，得到F4、F5两个片段。按质量比1∶6的比例混合F4和F5作为双模板，以P1和P2为引物进行第二次PCR扩增，PCR产物经DNA琼脂糖凝胶电泳分析确定后纯化回收，得到所需片段F6，大小为866 bp。同样用ClaI和SalI两个限制性内切酶对F6片段进行酶切，选取buffer3.1，室温下过夜酶切，对F6片段进行酶切体系回收。将酶切回收的F6片段和上述的pCI2骨架片段进行连接，转化，涂平板，挑单克隆，提质粒，进行酶切鉴定和测序。

1.2.5 重组质粒的蛋白表达：于6孔板内培养293细胞，当汇合度达到60%左右时，进行瞬时转染。将Opti-MEM培养基分别与lipo2000、质粒混合孵育，再将其混合置于37 ℃培养箱内30 min使形成复合体。将复合物加至细胞内，4 h后换新的完全培养基，24 h后收蛋白。配胶，电泳，电转，敷抗体，曝光。以转染pCI2空载质粒为对照组，运用Western blot检测2个重组质粒的蛋白表达情况。

2 结果

2.1 重叠PCR第一步产物 pCI2-Flag-YAP1-2γ经P1、P4和P2、P3两对引物PCR扩增后，得到F1、F2片段，长度分别为438 bp和573 bp，见图1A。pCI2-Flag-YAP1-2δ经P1、P5和P2、P6两对引物PCR扩增后，得到F4、F5片段，长度分别为135 bp和763 bp，见图1B。可作为第二步重叠PCR的模板。

图1 YAP1-2δ先导片段（A）和YAP1-1δ先导片段（B）的DNA琼脂糖凝胶电泳图

2.2 目的片段YAP1-2δ和YAP1-1δ 分别以F1、F2和F4、F5片段为模板，进行第二步重叠PCR，得到目的片段YAP1-2δ（长度为980 bp）以及YAP1-1δ（866 bp）。见图2。

图2 YAP1-1δ和YAP1-2δ片段的DNA琼脂糖凝胶电泳图

2.3 pCI2-YAP1-2γ质粒载体 质粒载体pCI2-Flag-YAP1-2γ经琼脂糖凝胶电泳后条带见图3。质粒经ClaI和SalI双酶切后，DNA电泳可见4500 bp和1000 bp左右2条条带，切取4500 bp左右条带胶回收，用于后续连接使用。

图3 pCI2-Flag-YAP1-2γ原质粒及酶切的琼脂糖凝胶电泳图

2.4 重组质粒双酶切及基因测序 用EcoRI和SalI两个限制性内切酶对重组质粒pCI2-Flag-YAP1-2δ和pCI2-Flag-YAP1-1δ进行双酶切，分别显示有4000 bp和1500 bp左右大小的条带，与预期相符（见图4A）。且测序结果比对正确（见图4B-C）。重组质粒构建成功且无突变。

2.5 YAP1-1δ和YAP1-2δ蛋白表达 将重组质粒在293细胞中做瞬时转染，以转染pCI2-Flag空载质粒为对照。可见YAP1-1δ和YAP1-2δ蛋白表达量远高于对照组（见图5）。说明真核表达重组质粒构建成功且成功过表达蛋白。

图4 重组质粒酶切鉴定（A）、YAP1-1δ测序结果（B）和YAP1-2δ测序结果（C）

图5 重组质粒在293细胞中的蛋白表达

3 讨论

Hippo信号通路最早在1995年于果蝇体内发现，是一条高度保守的信号通道。Hippo信号通路与肿瘤的发生和发展有着重要的关系[11-12]。YAP1作为其重要的下游效应分子[13]，其异常表达与肿瘤的发生发展紧密相关[14-16]。研究表明，在肝癌、胃癌[17]、胰腺癌[18]、结直肠癌、宫颈癌、卵巢癌[19]等多种实体肿瘤中都不同程度的YAP1高表达。

在哺乳动物中，YAP1基因所转录的mRNA经过修饰后会翻译出8种不同的YAP1蛋白，表明YAP1拥有8个亚型，它们的结构存在着显著差异但又有一定的规律。这些结构上的差异可能就会对肿瘤的形成和发展产生不同的影响。YAP1的WW结构域可以与PPxY模体相结合。许多调节YAP1降解与核定位的调控蛋白，都含有PPxY模体，比如LATS1/2[20]、AMOT[21]、PTPN14等。那么WW域数量的不同就有可能影响YAP1和这些蛋白的结合，从而引起降解或通路的激活。除此之外，YAP1作为一个辅助转录因子，可以通过WW结构域与SMAD1[22]和ZEB1[23]结合，SMAD1和ZEB1是促进肿瘤细胞EMT进程的转录因子，增强肿瘤细胞的侵袭转移能力，那么YAP1与它们的亲和力不同就会导致不一样的肿瘤转移能力。而现今并没有研究报道YAP1各个亚型在生化特性和转录活性上的区别。

由于YAP1各个亚型在肿瘤细胞中的丰度很低，若想直接从cDNA中克隆获取会耗时耗力，这也可能是为什么至今还没有关于YAP1各个亚型的研究报道。而且YAP1基因片段较长，其5’端GC含量又很高，若直接PCR则很难获得正确的基因片段，且错配率会大大增加。所以本研究根据YAP1各个亚型间的结构差异，即删除或增加特定的碱基，选择通过重叠PCR的方法，先分别合成前后2段序列，这2段序列有部分重叠段，再进行第2次PCR让这2段DNA结合并向两端延伸得到所需目的片段。此方法可以在构建YAP1各个亚型中灵活运用，通过设计不同的引物，由一个亚型可衍生出其他亚型，大大减少工作量，降低错配率，更加方便快捷。以pCI2-Flag-YAP1-2γ为模板，成功构建pCI2-Flag-YAP1-1δ和pCI2-Flag-YAP1-2δ两个真核表达的重组质粒。并在细胞内成功表达YAP1-1δ和YAP1-2δ蛋白。这2个亚型间的区别就在于WW结构域的数量，这对于后续构建慢病毒载体质粒，以及研究转录因子与WW结构域的结合能力等提供了必要的条件，为找出具体是哪个YAP1亚型在肿瘤的形成和发展中起到关键作用奠定基础。

参考文献：

[1] SANDESC M, DINU A, ROGOBETE A F, et al. Circulating microRNAs expressions as genetic biomarkers in pancreatic cancer patients continuous non-invasive monitoring[J]. Clin Lab, 2017, 63(10): 1561-1566.

[2] CHEN Y, SHI Y, YAN H, et al. Timing of chemotherapy-induced neutropenia: the prognostic factor in advanced pancreatic cancer patients treated with gemcitabine/gemcitabine-based chemotherapy[J]. Oncotarget, 2017, 8(39):66593-66600.

[3] ZHANG W, NANDAKUMAR N, SHI Y, et al. Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma[J]. Sci Signal, 2014, 7(324): ra42.

[4] NGUYEN L T, TRETIAKOVA M S, SILVIS M R, et al.ERG activates the YAP1 transcriptional program and induces the development of age-related prostate tumors[J]. Cancer Cell, 2015, 27(6): 797-808.

[5] MELFIS, COLCIAGO A, GIANNOTTI G, et al. Stressing out the Hippo/YAP signaling pathway: toward a new role in Schwann cells[J]. Cell Death Dis, 2015, 6: e1915.

[6] CAO X, PFAFF S L, GAGE F H. YAP regulates neural progenitor cell number via the TEA domain transcription factor[J]. Genes Dev, 2008, 22(23): 3320-3334.

[7] PLOUFFE S W, HONG A W, GUAN K L. Disease implications of the Hippo/YAP pathway[J]. Trends Mol Med, 2015,21(4): 212-222.

[8] SUDOL M. YAP1 oncogene and its eight isoforms[J]. Oncogene, 2013, 32(33): 3922.

[9] SUDOL M. Newcomers to the WW domain-mediated network of the hippo tumor suppressor pathway[J]. Genes Cancer, 2010, 1(11): 1115-1118.

[10] 丁鑫, 孟刚, 童晓玲, 等. WW结构域与Hippo信号通路[J].蚕业科学, 2013, 39(6): 1177-1185.

[11] 李敏睿, 张盛洪, 钟碧慧. Hippo信号通路在恶性肿瘤及干细胞中的作用[J]. 胃肠病学和肝病学杂志, 2013, 22(4):389-392.

[12] 邱勤明, 石秋燕, 王江, 等. Hippo信号通路与肿瘤发生的研究进展[J]. 四川生理科学杂志, 2016, 38(1): 35-38.

[13] HALL C A, WANG R, MIAO J, et al. Hippo pathway effector Yap is an ovarian cancer oncogene[J]. Cancer Res, 2010,70(21): 8517-8525.

[14] 白帆, 刘小龙, 易俊, 等. Hippo通路与恶性肿瘤侵袭转移的相关性研究进展[J]. 癌症进展, 2016, 14(3): 213-216.

[15] 史梦婕, 邵松军, 李洁媚, 等. Hippo通路与肿瘤相关性研究进展[J]. 中国细胞生物学学报, 2014, 36(3): 361-365.

[16] 吴卉, 花荣, 陈锦先. Hippo通路及靶因子Y A P与肿瘤关系的研究进展[J]. 实用医学杂志, 2013, 29(4): 515-517.

[17] 周广玺, 张翠萍, 魏文超, 等. 慢性胃炎及微环境与胃癌[J]. 齐鲁医学杂志, 2014, 29(2): 177-180.

[18] 王杰, 喻超, 周显飞, 等. MiRNA-138-5 p抑制人胰腺癌细胞增殖能力[J]. 世界华人消化杂志, 2016, 24(28): 3970-3977.

[19] 周青峰, 罗慧, 朱雪琼. Yes相关蛋白在妇科恶性肿瘤中的研究进展[J]. 温州医科大学学报, 2016, 46(7): 543-547.

[20] PAN D. The hippo signaling pathway in development and cancer[J]. Dev Cell, 2010, 19(4): 491-505.

[21] LEUNG C Y, ZERNICKA-GOETZ M. Angiomotin prevents pluripotent lineage differentiation in mouse embryos via Hippo pathway-dependent and -independent mechanisms[J].Nat Commun, 2013, 4: 2251.

[22] ARAGÓN E, GOERNER N, ZAROMYTIDOU A I, et al. A Smad action turnover switch operated by WW domain readers of a phosphoserine code[J]. Genes Dev, 2011, 25(12):1275-1288.

[23] LEHMANN W, MOSSMANN D, KLEEMANN J, et al.ZEB1 turns into a transcriptional activator by interacting with YAP1 in aggressive cancer types[J]. Nat Commun,2016, 7: 10498.