大鼠脾虚证发展进程与心肌能量代谢变化的关系

屈小虎，陈慧，黄玲，吕斌，金丽琴

（温州医科大学 检验医学院、生命科学学院，浙江 温州 325035）

中医之脾脏被称作“后天之本”，气血生化之源[1-3]。脾病则元气衰少，各脏腑组织皆失其养而百病丛生[4-6]。清・沈金鳌《杂病源流犀烛・虚损痨瘵源流》云“虚者，气血之虚。损者，脏腑之损。虚久致损，五脏皆有”[7]。脾主肌肉，人体的肌肉组织包括骨骼肌、心肌和平滑肌3种[8]，“脾病则四肢不用”，但涉及脾虚病发生发展过程中心肌组织的能量代谢功能变化的研究报道较少。本研究通过构建脾气虚证和脾不统血证大鼠模型，探究脾虚证由浅及深的发生发展动态过程与心肌组织能量代谢变化的关系，来阐明中医脾气虚弱，则气血生化无源，五脏无所滋养，而积渐流于虚弱的理论观点。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF级雄性SD大鼠，7～8周龄，48只，体质量300～350 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号：SYXK（浙）2015-0009。

1.1.2 药物和试剂：低分子肝素钠注射液的制备：低分子肝素钠（吉派林，杭州九源基因工程有限公司，批号：H19990036），用0.9%的氯化钠溶液稀释至1 U/μL。ATP检测试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。DNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型复制：将48只SD雄性大鼠随机分为4组，分别为正常对照组、低分子肝素钠组、脾气虚组、脾不统血组，每组12只。所有大鼠实验前预游泳筛选，弃除游泳时间小于15 min的大鼠。造模期间，正常对照组与低分子肝素钠组自由饮食饮水，脾气虚组大鼠与脾不统血组大鼠采用游泳疲劳加饮食失节法处理，即连续每天将大鼠放于（35±2）℃水中游泳30 min，同时限制饮食（饮食1 d禁食2 d作为1个循环），连续处理14个循环（即42 d）后，观察到大鼠出现明显的食少、懒动、形体消瘦、大便溏泄等症状即为脾气虚造模成功。之后，在维持上述处理因素的基础上，对低分子肝素钠组大鼠和脾不统血组大鼠皮下注射低分子肝素钠处理，即连续每天腹部皮下注射低分子肝素钠，注射剂量为2000 U・kg-1・d-1。同时，正常对照组和脾气虚组皮下注射相应量的0.9%氯化钠溶液作为对照。当持续注射15～18 d时，2组大鼠皮下出血症状均有减轻甚至消失，此时，4组大鼠均随机选出6只处死，并取出心肌组织冻存于-80 ℃冰箱中，此为造模中期。剩余大鼠继续饲养并施加处理因素，当注射30～33 d时，观察到脾不统血组大鼠腹部出现较严重的不可逆皮下出血症状，便潜血检测为阳性，脾不统血大鼠造模成功。处死大鼠解剖并取出所需组织冻存于-80 ℃冰箱中，此为造模末期。具体造模方法参考本课题组前期的研究基础[9]。

1.2.2 心肌组织ATP含量以及线粒体柠檬酸合酶[citrate（Si）-synthase，CS]和呼吸链复合物（Complex I、Complex II、Complex III、Complex IV）活性检测：采用ATP检测试剂盒测定实验大鼠心肌组织ATP含量，操作步骤严格按照说明书进行；CS和呼吸链复合物活性检测方法参照文献[10]进行。

1.2.3 心肌组织线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷贝数检测：采用DNA提取试剂盒进行组织DNA提取。从PubMed系统查询ND1和β-actin基因mRNA的NM号和序列，按照引物设计原则进行设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成。基因引物序列为：ND1上游引物5’-GGGATGAGCCTCAAATTCAA-3’，下游引物5’-GGAGCCGCTTATTAGGAGGA-3’；β-actin上游引物5’-TGTCACCAACTGGGACGATA-3’，下游引物5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’。

参照荧光定量PCR试剂盒说明书配制荧光定量PCR体系并设定反应条件。每组样本按编号顺序上样，各样本设2个复孔。使用CFX-96实时荧光定量PCR仪进行扩增反应，反应条件如下：95 ℃预变性10 s；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，反复40个循环；95 ℃ 5 s后结束程序。导出最终的扩增结果，根据公式计算各样本线粒体DNA拷贝数的相对含量进行统计学分析。

1.2.4 心肌组织COXIV和Cyt-C蛋白表达量检测：采用Western blot检测目的蛋白在大鼠心肌中表达量的变化，即剪取心肌组织提取蛋白，制备样品后进行SDS-PAGE电泳，蛋白转膜封闭后孵育相应抗体显色曝光，最后用Image-J软件灰度分析目的蛋白和内参蛋白条带的平均光密度并统计分析。

1.2.5 心肌组织COXIV和Cyt-C的mRNA表达量检测：采用Trozol手工法提取组织RNA后，利用RNA反转录试剂盒进行反转录合成cDNA。引物合成及其序列号：从PubMed系统查询目的基因mRNA的NM号和序列，按照引物设计原则进行设计，由上海生工生物工程股份有限公司合成。基因引物序列为：β-actin上游引物5’-TGTCACCAACTGGGACGATA-3’，下游引物5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’；Cyt-C上游引物5’-AGG TATCACCTGGGGAGAGG-3’，下游引物5’-GTCTGCCCTTTCT CCCTTCT-3’；COXIV上游引物5’-AGAAGGCCCTGAAGGAGA AG-3’，下游引物5’-ACTCATTGGTGCCCTTGTTC-3’。

参照SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）试剂盒说明书配制荧光定量PCR体系并设定反应条件。每组样本按编号顺序上样，各样本设2个复孔。使用CFX-96实时荧光定量PCR仪进行扩增反应，反应条件如下：95 ℃预变性1 min；95 ℃ 10 s，58 ℃30 s，反复39个循环；95 ℃ 5 s后结束程序。导出最终的扩增结果，根据公式计算各样本mtDNA拷贝数的相对含量进行统计学分析。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS17.0软件进行统计分析，并用Graphpad Prism6.0软件作图。所有数据以±SEM表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌组织ATP含量变化 与正常对照组比，末期的脾气虚组和脾不统血组大鼠心肌的ATP含量均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），但中期的脾气虚组和脾不统血组大鼠心肌的ATP含量较正常对照组差异无统计学意义（P＞0.05）；与脾气虚组比，中期和末期的脾不统血组大鼠心肌ATP含量差异无统计学意义（P＞0.05）；与低分子肝素钠组比，中期和末期的脾不统血组大鼠心肌的ATP含量降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠不同时期心肌ATP含量（n=6，±SEM，μmol/g）

表1 各组大鼠不同时期心肌ATP含量（n=6，±SEM，μmol/g）

与正常对照组比：aP＜0.05，bP＜0.01；与低分子肝素钠组比：cP＜0.05，dP＜0.01

2.2 心肌CS活性变化 与正常对照组比，中期和末期的脾气虚组和脾不统血组大鼠心肌CS活性显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与脾气虚组比，中期和末期的脾不统血组大鼠心肌CS活性有所降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与低分子肝素钠组比，中期和末期的脾不统血组大鼠心肌CS活性降低，差异有统计学意义（P＜0.01），见图1。

图1 各组大鼠不同时期心肌CS活性比较（n=6）

2.3 心肌线粒体复合物活性变化 与正常对照组比，中期的脾气虚组和脾不统血组大鼠心肌组织Complex I、Complex II的活性显著升高，脾气虚组Complex IV及脾不统血组Complex III、Complex IV的活性显著降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），末期的脾气虚组和脾不统血组大鼠心肌Complex I、Complex II、Complex III、Complex IV的活性显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与脾气虚组比，中期的脾不统血组大鼠心肌Complex I的活性有所升高，而Complex III的活性有所降低，差异均有统计学意义（P＜0.05），而末期的脾不统血组心肌4种复合物活性与脾气虚组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）；与低分子肝素钠组比，中期脾不统血组大鼠心肌Complex I、Complex III、Complex IV活性呈降低趋势，末期脾不统血组大鼠心肌Complex I、Complex IV活性呈降低趋势，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2。

2.4 心肌mtDNA拷贝数变化 与正常对照组比，中期和末期的脾不统血组大鼠心肌mtDNA拷贝数显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），但与脾气虚组比，中期和末期的脾不统血组大鼠心肌mtDNA拷贝数差异均无统计学意义（P＞0.05）；与低分子肝素钠组比，中期和末期脾不统血组的大鼠心肌mtDNA拷贝数差异均无统计学意义（P＞0.05），见图3。

图2 各组大鼠不同时期心肌线粒体复合物活性比较（n=6）

图3 各组大鼠不同时期心肌mtDNA拷贝数比较（n=6）

2.5 心肌组织COXIV蛋白和Cyt-C蛋白表达量变化与正常对照组比，末期的脾气虚组大鼠心肌COXIV蛋白表达量显著降低，中期和末期的脾不统血组COXIV蛋白表达量也显著降低，中期的脾气虚组Cyt-C蛋白表达量显著降低，而末期的脾不统血组Cyt-C蛋白表达量显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与脾气虚组比，中期和末期的脾不统血组大鼠心肌Cyt-C蛋白表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与低分子肝素钠组比，中期和末期的脾不统血组大鼠心肌COXIV蛋白表达量均呈降低趋势，末期脾不统血组大鼠心肌Cyt-C蛋白表达量呈升高趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

2.6 心肌组织COXIV和Cyt-C的mRNA相对表达量变化 与正常对照组比，中期和末期的脾气虚组和脾不统血组大鼠心肌COXIV的mRNA表达量显著降低，中期的脾气虚组Cyt-C的mRNA表达量显著降低，末期的脾不统血组Cyt-C的mRNA表达量显著升高，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与脾气虚组比，中期的脾不统血组Cyt-C的mRNA表达量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与低分子肝素钠组比，中期和末期脾不统血组大鼠心肌COXIV的mRNA表达量呈降低趋势，末期脾不统血组大鼠心肌Cyt-C的mRNA表达量呈升高趋势，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

图4 各组大鼠不同时期心肌组织COXIV、Cyt-C的蛋白相对表达量比较（n=6）

图5 各组大鼠不同时期心肌组织COXIV、Cyt-C的mRNA相对表达量比较（n=6）

3 讨论

中医认为，周身之肌肉皆由脾胃所运化水谷精微荣养，才能健壮丰满[11-13]。中医脾主肌肉，心肌组织的功能与脾脏密切相关。心脏具有推动血液运行的重要作用，也是能量代谢极为旺盛的组织。脾脏虚弱则肌肉消瘦，气虚乏力，不耐劳作[14-15]，机体能量代谢出现障碍，细胞线粒体功能出现异常[16]。有学者通过研究脾气虚证大鼠心肌线粒体变化并进行药物干预，发现脾气虚影响心肌线粒体突变和缺失，导致线粒体氧化代谢相关酶活性改变[17]。中医脾气虚证以脾脏虚弱，脾气耗损，运化失常为主要特征，表现为少气乏力，形体瘦弱，肢体疲乏等；脾不统血证是在脾气虚基础上发生的，由于脾气虚弱，无力统摄血液循行脉中造成出血，临床表现包括脾气虚症状和皮下出血、便血等，是更为严重的气虚血虚病证。本研究联合两种病证，通过脾气虚发生发展形成脾不统血，将脾不统血证成模过程分为中期和末期，探讨心肌组织能量代谢的变化。

本研究结果显示，末期脾气虚组和脾不统血组大鼠心肌组织ATP含量较正常对照组显著降低，但2组间没有显著差异，提示随着脾虚证的持久，心肌线粒体能量代谢发生了异常变化，但2种脾虚证在心肌能量代谢方面并未出现差异。进一步检测发现，脾气虚组和脾不统血组大鼠心肌组织的CS活性均显著低于正常对照组，提示脾虚证大鼠心肌CS活性存在异常变化；脾不统血组大鼠CS活性显著低于脾气虚组，提示大鼠脾气虚证发展为脾不统血证，心肌CS活性降低。而从心肌线粒体呼吸链复合物活性的检测结果来看，末期的脾气虚组和脾不统血组大鼠的4种复合物活性显著低于正常对照组，但2组大鼠之间没有显著差异，与心肌ATP含量的变化趋势相一致，表示心肌合成ATP的能力发生了损伤，提示脾虚证中，心肌线粒体能量合成被严重影响，但这种影响在脾气久虚时表现得较为显著。

检测发现，脾不统血组大鼠mtDNA拷贝数较正常对照组升高，而脾气虚组大鼠mtDNA拷贝数虽略显升高，但较正常对照组和脾不统血组差异均无统计学意义，提示脾虚证中，心肌组织mtDNA产生显著变化需要较长的疾病时间。

结果显示，中期脾不统血组大鼠COXIV蛋白以及脾气虚组大鼠Cyt-C蛋白的表达量较正常对照组降低，末期脾气虚组和脾不统血组大鼠COXIV蛋白表达量较正常对照组降低，脾不统血组大鼠Cyt-C蛋白表达量较正常对照组升高，而脾气虚组大鼠Cyt-C蛋白表达量较正常对照组无显著差异，提示脾虚证早期，由于线粒体呼吸链相关蛋白表达变化的影响，心肌线粒体合成ATP的能力下降，随着脾虚病持久影响，脾气虚证加重和脾不统血证的形成都能使心肌线粒体呼吸链相关蛋白发生变化，导致心肌线粒体合成ATP的能力持续下降，并且心肌细胞有凋亡的趋势。同时，脾气虚组大鼠和脾不统血组大鼠心肌COXIV和Cyt-C的mRNA相对表达量变化与其蛋白表达量变化趋势基本一致，提示脾虚证大鼠心肌组织能量代谢异常存在基因表达水平的改变。

本研究通过测定脾气虚证和脾不统血证大鼠心肌ATP含量、CS活性、线粒体呼吸链复合物活性、mtDNA拷贝数、COXIV蛋白和Cyt-C蛋白及其mRNA表达量的变化，从结果可以看出，大鼠在疾病早期发病过程中，脾气虚证并没有显著影响到心肌组织能量代谢，随着脾虚病的病程加长以及脾气虚证向脾不统血证的转变，大鼠心肌组织能量代谢功能发生了障碍，ATP含量显著降低，柠檬酸循环和氧化磷酸化相关酶活性及代谢中重要蛋白和基因的表达都发生了改变，说明脾虚证对大鼠心肌组织是有不利影响的，而这种影响随着脾虚证的加重而越来越明显。脾虚病程加长及脾气虚证向脾不统血证的转变，大鼠心肌组织能量代谢功能逐渐发生障碍，正是中医脾气虚弱，气血生化无源，五脏无所滋养，而积渐流于虚弱的营养与生化机制。

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