金属元素Cu、Fe对肝素钠氧化过程的影响

田志鹏，李志敏，黄 栋，李利娜，王 亮

(河北常山生化药业股份有限公司，河北 石家庄 050800)

肝素是一种高度硫酸化的糖胺聚糖[1]，作为一线抗凝血药物，在临床应用已达80余年[2-4]，目前主要用于预防深静脉血栓和肺栓塞的形成[5-6]。肝素在医药领域有着举足轻重的地位，受到世界各国的广泛重视，同时也是我国主要的出口药物之一[7-8]。肝素钠生产主要以猪小肠黏膜为起始原料，提取过程中首先去除大量杂质得到肝素粗品，然后对肝素粗品进行溶解、盐解、热变性、氧化等处理，最终精制纯化得到肝素钠精品[9]。

肝素钠可以直接制成肝素钠制剂供临床使用，也可以进一步加工，降解为低分子量肝素。《中华人民共和国药典》(2020年版)肝素钠质量标准包括性状、比旋度、鉴别、有关物质、酸碱度、溶液澄清度与颜色、分子量及分子量分布、效价、核酸与蛋白质含量、重金属含量等指标[10]。其中，分子量及分子量分布要求重均分子量应为15 000～19 000 Da，分子量大于24 000 Da的级分不得大于20%，且分子量8 000～16 000 Da的级分与分子量16 000～24 000 Da的级分比应不小于1.0；而效价测定要求抗Ⅱa因子效价(干品计)≥180 IU·mg-1，抗Xa因子效价与抗Ⅱa因子效价比应为0.9～1.1。

肝素钠的生产应从源头开始进行全过程控制，以保证最终产品的质量[11]。肝素钠中的元素杂质主要来源于生产过程中用到的原辅料、生产设备、纯化水和包装材料，其中可能引入的元素杂质为锰(Mn)、铬(Cr)、镍(Ni)、铜(Cu)、钼(Mo)、钛(Ti)、铁(Fe)、钒(V)、砷(As)、铅(Pb)、钙(Ca)、镁(Mg)等。而Cu、Fe作为常见金属元素，被引入的风险较大。为此，作者在不同条件下制备肝素钠，通过测定肝素钠的分子量及分子量分布、效价、二糖组成，研究金属元素Cu、Fe对肝素钠氧化过程的影响，拟对肝素钠的质量控制提供技术支持。

1 实验

1.1 试剂与仪器

肝素钠粗品(除蛋白)，河北常山生化药业股份有限公司；30%过氧化氢，西陇科学股份有限公司；盐酸，烟台双双化工有限公司；氢氧化钠，天津永大化学试剂有限公司；氯化钠，河北华晨药业有限公司；乙醇，梅河口阜康酒精有限公司；铜标准溶液(1 000 μg·mL-1)、铁标准溶液(1 000 μg·mL-1)，国家有色金属及电子材料分析测试中心；肝素钠二糖标准品(ΔⅠA、ΔⅡA、ΔⅢA、ΔⅣA、ΔⅠS、ΔⅡS、ΔⅢS、ΔⅣS)，英国Dextra 公司；高氯酸钠，上海凌峰化学试剂有限公司。

HH-8S型数显恒温水浴锅，常州国华电器公司；FE28型精密pH计，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；0.45 μm滤膜，默克化工技术有限公司；DZF-6210型真空干燥箱，上海一恒科技有限公司；S10-2型恒温磁力搅拌器，上海司乐仪器有限公司；Ultimate 3000型高效液相色谱仪，美国热电。

1.2 肝素钠样品的制备

组别设置：对照组CG、实验组EGC、实验组EGI。对照组CG：不含Cu2+、Fe3+；实验组EGC：加入铜标准溶液，使Cu2+浓度分别为10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1，依次记为EGC-1～EGC-4；实验组EGI：加入铁标准溶液，使Fe3+浓度分别为10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1，依次记为EGI-1～EGI-4。

制备方法：参照文献[12]，将10 g肝素钠粗品加入到150 mL纯化水中，搅拌溶解，按组别设置分别加入铜标准溶液或铁标准溶液，加入氯化钠4.5 g，搅拌溶解；升温至30 ℃，调节pH值至10.0；加入30%过氧化氢4.5 mL，氧化36 h，监控温度、pH值，若有偏离及时调整；将氧化后的溶液过滤，调节pH值至6.2，加入95%乙醇沉淀，静置12 h；收集沉淀，研磨，乙醇脱水，60 ℃下真空干燥，即得肝素钠样品。

1.3 分析方法

1.3.1 分子量及分子量分布

参照《中华人民共和国药典》(2020年版)四部通则0514分子排阻色谱法测定肝素钠分子量及分子量分布。

取肝素钠样品、肝素钠分子量对照品适量，分别加流动相溶解并稀释成浓度为5 mg·mL-1的溶液。以亲水性键合硅胶为填充剂(TSK预柱，6 mm×40 mm；TSKgel G4000SWXL，7.8 mm×300 mm；TSKgel G3000SWXL，7.8 mm×300 mm；串联使用)，以0.1 mol·L-1醋酸铵溶液为流动相，流速为0.6 mL·min-1，柱温为30 ℃，示差折光检测器，进样量为25 μL。取对照溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算肝素钠峰的总面积及每个点的累积峰面积百分比。以保留时间为横坐标、分子量的对数值为纵坐标，绘制校正曲线。另取肝素钠样品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，按下式计算肝素钠样品的重均分子量(MW)。

MW=∑(RiMi)/∑Ri

式中:Ri为洗脱的i级分的物质的量，即示差色谱图的峰高;Mi为由校正曲线计算得出的i级分的分子量。

1.3.2 效价

参照《中华人民共和国药典》(2020年版)四部通则1208肝素生物测定法测定抗Ⅱa因子、抗Xa因子效价。

1.3.3 二糖组成

精密称取肝素钠样品适量，加水溶解配制成20 mg·mL-1溶液；精密量取上述溶液20 μL、醋酸钙溶液(pH值 7.0)70 μL、肝素酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的混合溶液100 μL，混匀；于25 ℃水浴中酶解48 h，即为肝素钠样品溶液。另精密称取肝素钠二糖标准品ΔⅠA、ΔⅡA、ΔⅢA、ΔⅣA、ΔⅠS、ΔⅡS、ΔⅢS、ΔⅣS适量，加水溶解配制成0.25 mg·mL-1标准溶液。

以标准溶液中各肝素钠二糖的保留时间定性，参照《中华人民共和国药典》(2020年版)四部通则0512高效液相色谱法测定肝素钠样品溶液中二糖的相对含量。色谱条件：强阴离子交换柱(Thermo Hypersil SAX，250 mm×4.6 mm)；0.028%磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值至3.0)为流动相A，高氯酸钠-磷酸盐溶液(取高氯酸钠140 g，用流动相A溶解并稀释至1 000 mL，用磷酸调节pH值至3.0)为流动相B；流速0.45 mL·min-1；检测波长234 nm；柱温50 ℃；进样量10 μL。按表1进行线性梯度洗脱。

表1 流动相线性梯度洗脱条件

2 结果与讨论

2.1 Cu2+、Fe3+对肝素钠分子量及分子量分布的影响(表2)

由表2可以看出，与对照组CG相比，当Cu2+、Fe3+的含量较少时，肝素钠分子量及分子量分布变化较小；随着含量的增加，分子量下降明显，低分子量的糖片段占比增加。说明在氧化过程中，Cu2+、Fe3+对肝素钠糖链具有破坏作用，由于肝素钠为多糖链混合物[13]，氧化过程中Cu2+或Fe3+催化过氧化氢产生自由基，使肝素钠糖链断裂，肝素钠发生降解，导致分子量降低，低分子量的糖片段占比增加。当Cu2+、Fe3+含量相同时，实验组EGC的肝素钠分子量比实验组EGI的低，说明相同条件下，Cu2+对肝素钠的破坏作用较Fe3+的强一些。

表2 Cu2+、Fe3+对肝素钠分子量及分子量分布的影响

2.2 Cu2+、Fe3+对肝素钠效价的影响(表3)

表3 Cu2+、Fe3+对肝素钠效价的影响

经检测，肝素钠粗品(除蛋白)的抗Ⅱa因子效价为191.7 IU·mg-1。由表3可以看出，当Cu2+、Fe3+含量低于20 mg·L-1时，肝素钠效价与对照组CG相比变化不大；但随着Cu2+、Fe3+含量的增加，效价及效价回收率下降明显。由于肝素钠抗凝的主要机制在于它能结合血浆中的一些抗凝蛋白，使抗凝蛋白的活性增强，而抗凝活性主要取决于可与抗凝血酶结合的特异性五糖序列；Cu2+、Fe3+的破坏作用使肝素钠糖苷键断裂，在特异性五糖序列上发生裂解，从而导致效价及效价回收率降低。同样，相同含量下，Cu2+对肝素钠效价的影响大于Fe3+。

2.3 Cu2+、Fe3+对肝素钠二糖组成的影响

通过直接比对肝素钠二糖标准品和肝素钠酶解产物在SAX-HPLC系统上分离的出峰时间就可以确定肝素钠的结构。对照组CG、实验组EGC和实验组EGI的肝素钠二糖的HPLC图谱见图1。

1.ΔⅣA 2.ΔⅣS 3.ΔⅡA 4.ΔⅢA 5.ΔⅡS 6.ΔⅢS 7.ΔⅠA 8.ΔⅠS

由图1a可以看出，常见的8种肝素钠二糖标准品的出峰时间如下:ΔⅣA(7.1 min)，ΔⅣS(14.2 min)，ΔⅡA(15.8 min)，ΔⅢA(17.5 min)，ΔⅡS(20.8 min)，ΔⅢS(22.6 min)，ΔⅠA(25.6 min)，ΔⅠS(29.2 min);实验组EGC、EGI的肝素钠二糖出峰时间与对照组CG的基本一致。

二糖组成分析是评价肝素钠序列、结构组成和质量的最重要的方法之一。对照组CG、实验组EGC和实验组EGI的肝素钠二糖组成分析见表4。

表4 肝素钠二糖组成分析结果

由表4可以看出，Cu2+、Fe3+含量较少时，肝素钠二糖组成变化相对于对照组CG不是很明显；随着Cu2+、Fe3+含量的增加，ΔⅣA的相对含量整体逐渐升高，同时肝素钠主要二糖ΔⅠS的相对含量逐渐降低，且Cu2+对二糖组成变化的影响更为明显。

2.4 讨论

本研究在考察金属元素Cu、Fe对肝素钠氧化过程的影响时，采用的是一次加入过氧化氢的一次氧化，而当前肝素钠精制工艺广泛采用的是两次加入过氧化氢的二次氧化[14]。氧化次数的增加势必会增强Cu2+、Fe3+对肝素钠结构的破坏作用，对肝素钠成品产生更大影响。

因此，在肝素钠生产过程中应对所用粗品、辅料、工艺用水、生产设备中可能引入的Cu2+、Fe3+进行风险控制，必要时应增加Cu2+、Fe3+的去除工艺，以保证肝素钠产品质量。

3 结论

Cu、Fe的存在会对肝素钠的氧化过程产生影响，使肝素钠糖苷键断裂、分子量降低、分子量分布发生变化、低分子量的糖片段占比增加，同时，也影响肝素钠的效价，使效价及效价回收率降低，造成产品质量不达标。Cu、Fe对肝素钠的影响与其含量有很大关系。体系中Cu2+、Fe3+含量越多，对肝素钠的破坏作用越强，分子量及效价下降越明显，且相同含量下Cu2+的破坏作用强于Fe3+；体系中Cu2+、Fe3+的含量越多，肝素钠二糖ΔⅣA的相对含量整体越高，主要二糖ΔⅠS的相对含量则越低。