泡菜中1株植物乳杆菌所产细菌素的生物学特性

邢少华，刘文丽，贡汉生，刘晔，都灵玮，王飞，鲁畅

(鲁东大学 食品工程学院，山东 烟台　264025)

细菌素是由细菌的基因组DNA编码，由核糖体合成的一类蛋白质或多肽类物质，具有天然抗菌能力和易降解的特性[1,2]。乳酸菌产生的细菌素通常可分为四大类：Ⅰ类为羊毛硫抗生素；Ⅱ类是小分子的热稳定肽，相对分子质量小(<10 kDa)，Ⅱ类细菌素又可以分为Ⅱa、Ⅱb和Ⅱc等6个亚组；Ⅲ类是热敏感大分子蛋白(LHLP)，在实际生产中应用并不广泛；第Ⅳ类是复合型的大分子复合物[3，4]。

细菌素作为一种天然的食品防腐剂在发达国家被广泛使用。如nisin(乳链菌肽)早在20世纪50，60年代就已被欧洲多个国家允许作为食品防腐剂，1988年美国FDA允许其在再制乳酪中使用。尽管现在已经有很多除nisin A以外的细菌素被陆续报道出来，但细菌素在食品行业的应用依然十分匮乏。因此，为了开发出具有应用前景的细菌素产品，许多研究人员致力于筛选具有高效广谱抑菌性的细菌素合成菌株[5，6]。

泡菜是一种传统的发酵食品，乳酸菌是其中最主要的微生物菌群[7，8]。乳酸菌发酵过程中可产生多种天然抑菌物质，可以有效抑制腐败菌和病原菌的生长，其中乳酸菌产细菌素成为近年来研究的热点[9]。本研究从自制萝卜泡菜中筛选出1株具有抑制革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌的广谱抑菌性乳酸菌，并鉴定该菌为植物乳杆菌。通过对该植物乳杆菌代谢产物的抑菌性研究发现，其主要抑菌物质为细菌素，并对该细菌素的生产曲线、耐热性、耐酸碱性等生理特性进行了研究，以期为开发新型食品级生物保鲜剂奠定基础。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

实验用泡菜为实验室自制萝卜泡菜。

过氧化氢酶、α-胰凝乳蛋白酶、链霉蛋白酶、胰蛋白酶：美国Sigma公司；PCR Master Mix：立陶宛Thermo Scientific公司；其他试剂：均为国产分析纯。

1.2　实验菌株及培养基

抑菌用指示菌株包括5株革兰氏阳性菌：藤黄微球菌 ATCC13513、枯草芽孢杆菌 ATCC6633、蜡状芽孢杆菌 ATCC27348、植物乳杆菌 ATCC8014、单增李斯特菌 ATCC19113；3株革兰氏阴性菌：鼠伤寒沙门氏菌 ATCC14028、大肠杆菌 ATCC25922、副溶血性弧菌 ATCC27969。

乳酸菌选用MRS培养基，单增李斯特菌选用BHI培养基，副溶血性弧菌选用TSA培养基，其他指示菌选用营养肉汤培养基。

1.3　仪器与设备

pB-10型pH计新锐仪表仪器有限公司；721G型分光光度计上海精密科学仪器有限公司；细菌基因组提取试剂盒天根生化科技有限公司；聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增仪杭州博日科技有限公司；DYY-10C型电泳仪北京市六一仪器厂。

1.4　方法

1.4.1乳酸菌的分离纯化

采用平板稀释法[10]，取实验室自制萝卜泡菜5～10 g，加入9倍的无菌蒸馏水粉碎混匀，梯度稀释至10-3～10-6浓度，平板涂布于含有0.5 g/dL CaCO3的MRS培养基上。30 ℃倒置培养48 h后观察菌株生长情况，选取有钙圈生成的菌落，挑取不同形态的单菌落，在MRS平板上划线培养3次，纯化为单一菌落。

1.4.2乳酸菌的初步确定及形态学观察

挑取纯化后的菌落进行革兰氏染色镜检观察和过氧化氢酶接触试验。革兰氏染色呈阳性且过氧化氢酶呈阴性的菌落初步判断为乳酸菌。经革兰氏染色镜检记录乳酸菌的形态特征。

1.4.3菌液pH测定

将纯化好的乳酸菌株培养于MRS液体培养基中，30 ℃培养24 h，用pB-10型pH计测定菌液pH并记录。

1.4.4乳酸菌的抑菌性测定

采用滤纸片-琼脂扩散法筛选具有抑菌活性的乳酸菌株[11]，指示菌分别选用革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，其中5株革兰氏阳性菌包括藤黄微球菌(营养肉汤培养基，37 ℃培养)、枯草芽孢杆菌(营养肉汤培养基，37 ℃培养)、蜡状芽孢杆菌(营养肉汤培养基，37 ℃培养)、植物乳杆菌(MRS培养基，30 ℃培养)和单增李斯特菌(BHI培养基，37 ℃培养)，3株革兰氏阴性菌包括鼠伤寒沙门氏菌(营养肉汤培养基，37 ℃培养)、大肠杆菌(营养肉汤培养基，37 ℃培养)和副溶血性弧菌(TSA培养基，37 ℃培养)。抑菌环直径用游标卡尺进行测量，抑菌环直径为3～6 mm，6～10 mm，以上2个范围分别用“+”、“++”表示其抑菌能力。

1.4.5PY5-7的生长曲线及抑菌性曲线

采用分光光度法测量PY5-7的生长曲线。将液体培养的PY5-7按照1%(V/V)的接种量接入MRS液体培养基中，于30 ℃培养48 h，每间隔3 h采用分光光度计测定1次吸光度(OD600),以时间为横坐标，OD600为纵坐标，做图得到PY5-7的生长曲线。同时，每间隔3 h取样1次，于4 ℃，6000×g条件下离心10 min，测定上清液对枯草芽孢杆菌的抑菌性，以PY5-7在测定时间内所产生的最大抑菌环直径作为基准，将其抑菌率定为100%，其他时间上清液的相对抑菌率为其抑菌环直径与最大抑菌环直径对比的百分率。以时间为横坐标，相对抑菌率为纵坐标，做图得到PY5-7的抑菌性-时间曲线。

1.4.6抑菌物质的初步确定[12]

使用10 mol/L的NaOH调节PY5-7的发酵上清液pH值至7.0，排除有机酸的干扰。加入过氧化氢酶，排除过氧化氢的干扰。将0.2 mg/mL的α-胰凝乳蛋白酶(α-chymotrypsin)、链霉蛋白酶(Pronase)和胰蛋白酶(Trypsin)做如下处理后分别加入PY5-7发酵上清液中：α-胰凝乳蛋白酶加入20 mmol/L Tris-HCl缓冲液调pH值为8.0；链霉蛋白酶加入20 mmol/L Tris-HCl缓冲液调pH值为7.8；胰蛋白酶加入20 mmol/L Tris-HCl缓冲液调pH值为8.0。37 ℃培养2 h，分别观察添加酶液前后发酵上清液抑菌情况的变化，以未经蛋白酶处理的作为对照组。

1.4.7抑菌物质耐热性的测定

将PY5-7发酵上清液分别在温度为70，80，90 ℃的水中恒温水浴加热0.5，1，2，3 h，冷却至室温后测定其抑菌活性，以常温下产生的抑菌圈作为对照[13]。

1.4.8抑菌物质的酸碱稳定性测定[14]

取等量的PY5-7发酵上清液，分别用20%的HCl或1 mol/L的NaOH调pH值至1.0～12.0，室温处理24 h调pH至7.0，测定其抑菌活性。

1.4.9糖酵解实验

将PY5-7接种于MRS培养基中，30 ℃条件下培养24 h，收获菌体并用无菌生理盐水洗涤2次。根据API 50CHL系统说明书将盐水菌悬液接种于试验条，30 ℃培养24～48 h后观察结果并判读反应类型，将判读结果输入系统测定软件API plus中，根据菌株可发酵糖反应类型确定其种类归属。

1.4.1016S rDNA序列分析

将筛选的乳酸菌株的基因组DNA进行PCR扩增，用1%琼脂糖进行凝胶电泳检测。使用细菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')扩增[15]，PCR产物送交上海生工生物工程技术服务有限公司纯化后测序，得到的PCR产物序列通过BLAST在GenBank中进行同源性比较，并将其鉴定到种。

2　结果与分析

2.1　泡菜中的乳酸菌的筛选

从自制萝卜泡菜中分离出7株产酸菌株，经过革兰氏染色阳性、过氧化氢触酶阴性及发酵产酸情况初步确定为乳酸菌株。通过革兰氏镜检显示5株菌为杆菌,占71.54%，这与发酵后期泡菜的酸度较高，具有耐酸性的杆菌往往比不耐酸的球菌数目要多有关。7株菌的24 h发酵液pH均在4.0～5.0之间，显示良好的产酸性。

2.2　乳酸菌的抑菌性测定结果

从泡菜分离出的7株乳酸菌中筛选出1株具有广谱抑菌性的菌株，命名为PY5-7。实验结果表明：PY5-7对5株革兰氏阳性菌均具有抑菌性；对3株革兰氏阴性菌也均具有抑菌性，实验结果见表1。

表1　PY5-7的抑菌性结果Table 1 Antimicrobial activity of PY5-7

注：“+”代表阳性，且抑菌环直径在3～6 mm之间；“++”代表阳性，且抑菌环直径在6～10 mm之间。

2.3　PY5-7菌株的一般特性

PY5-7单一菌落外观呈圆形，白色，中间颜色比周围稍深，见图1。菌株为革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，菌发酵液pH值为4.07，产酸性良好，结果见表2。PY5-7菌株为杆状菌，无鞭毛，不产芽孢，不运动，显微图片见图2。

表2　PY5-7的生化特性Table 2 Biochemical characteristics of PY5-7

图1 PY5-7菌落外观图Fig.1 The colony appearance of PY5-7

图2　PY5-7的革兰氏染色菌株形态特征Fig.2 The morphological characteristics of gram stain PY5-7

2.4　PY5-7的生长曲线及抑菌性曲线

采用比浊法测量PY5-7的生长曲线，测定600 nm外的OD值。每隔3 h取样1次测定OD600值，以时间为横坐标、OD600为纵坐标，绘制生长曲线，见图3。

图3　PY5-7的生长曲线Fig.3 Growth curve of PY5-7

由图3可知，PY5-7在0～24 h增殖迅速，24 h后菌株生长进入停滞期 。

采用滤纸片-琼脂扩散法测定PY5-7的抑菌性曲线。每隔3 h取样1次测定抑菌环的直径，以时间为横坐标、相对抑菌率为纵坐标，绘制抑菌性曲线，见图4。

图4　PY5-7的抑菌性曲线Fig.4 Antibacterial curve of PY5-7

由图4可知，PY5-7的抑菌性在菌株生长期逐渐升高，在发酵30 h时达到最大，略晚于菌数达到最大的时间，主要是由于细菌素属于二次代谢产物[16]。

2.5　抑菌性物质初步鉴定结果及蛋白酶敏感性实验结果

将PY5-7发酵上清液pH值调至7.0，发现抑菌效果无明显差别；将PY5-7发酵上清液经过氧化氢酶处理后，抑菌效果也无明显差别，从而排除了有机酸和过氧化氢的干扰。

确定抑菌活性物质是否具有蛋白质类的性质是确定抑菌活性物质是细菌素的关键。PY5-7发酵上清液经过不同的蛋白酶处理后，产生的抑菌圈直径有所不同，见表3。发酵上清液经α-胰凝乳蛋白酶、链霉蛋白酶和胰蛋白酶处理后，用α-胰凝乳蛋白酶处理的发酵上清液的抑菌性有一定程度的减小，用链霉蛋白酶处理的发酵上清液完全失去抑菌性，用胰蛋白酶处理的发酵上清液抑菌性与对照相比没有显著性差异，初步判定该菌株产生的抑菌物质为蛋白类物质，应为细菌素。PY5-7所产细菌素经不同蛋白酶处理后抑菌能力的改变有所不同，与不同蛋白酶的酶切位点不同有关。

表3　不同蛋白酶处理后的抑菌圈直径Table 3 The diameter of inhibition zone after treatment with different proteases

2.6　耐热性实验结果

将PY5-7发酵上清液分别在70，80，90 ℃下处理0.5～3 h，结果见表4。在 70 ℃条件下处理0.5，1，2，3 h后，PY5-7发酵上清液的抑菌性分别保留96.7%，94.6%，77.1%和25.3%；在 80 ℃条件下处理0.5，1，2，3 h后，PY5-7发酵上清液的抑菌性分别保留90.3%，95.7%，42.6%，10.8%；在90 ℃条件下处理0.5，1，2 h后，PY5-7发酵上清液的抑菌性分别保留72.7%，31.9%和2.3%。结果表明：该乳酸菌所产细菌素具有较强的耐热性，用于一般食品的热加工不会影响其抑菌效果。

表4　PY5-7细菌素的耐热性结果Table 4 The heat resistance of bacteriocin produced by PY5-7

注：a表示抑菌性以常温状态产生的抑菌圈作对照。

2.7　抑菌物质在不同pH条件下的活性

通过研究发现，PY5-7发酵上清液在pH值2.0～9.0之间抑菌活性较稳定，当pH为1.0及大于10.0的情况下，抑菌活性消失，结果见表5。这与文献中报道的乳酸菌细菌素的耐酸碱结果基本一致[17]。

表5　不同pH值的抑菌活性Table 5 Antimicrobial activity of different pH values

注：“+”表示有抑菌活性；“-”表示没有抑菌活性。

2.8　糖酵解实验结果

对菌株PY5-7进行49种碳水化合物的发酵结果进行判读，结果表明PY5-7可以利用L-阿拉伯糖、D-核糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、甘露醇、山梨醇、甲基-α-D-吡喃甘露糖苷、N-乙酰葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七叶灵柠檬酸铁、水杨苷、D-纤维二糖、D-麦芽糖、D-乳糖、D-蜜二糖、D-蔗糖、D-海藻糖、D-松三糖、D-棉子糖和D-土伦糖，经API plus软件分析鉴定，菌株PY5-7与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)有99.9%的同源性。

2.9　16S rDNA菌株鉴定结果

16S rDNA测序结果表明：PY5-7菌株与L.plantarumJCM1149(T) 的同源性达到99%以上，确定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，将其命名为LactobacillusplantarumPY5-7。

3　讨论

泡菜因其特殊的风味、酸脆的口感以及各种功能性倍受各国消费者的青睐。研究表明：泡菜具有减肥、防止皮肤老化、预防动脉硬化、抗病毒和抑制癌细胞生长等多种保健和医疗功效[18，19]。

泡菜发酵是由多种微生物菌群共同作用的结果，乳酸菌是其中数量最多，也是对泡菜的品质影响最大的最主要的微生物类群。乳酸菌能够降解原料中的糖、蛋白质等生物大分子，形成乳酸、氨基酸等物质，从而提高泡菜的营养价值[20]；同时，乳酸菌发酵过程产生的抑菌物质，可以有效抑制腐败菌和病原菌的生长，从而提高泡菜的保藏性及安全性[21]。

近年来，许多研究者从泡菜中筛选出一批具有抑菌性的乳酸菌株，如明串珠菌(Leuconostoccitreum)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)、Lactobacillusharbinensis、肠系膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)等[22-24]，并已将许多具有抑菌性的乳酸菌株重新应用于泡菜发酵，以提高泡菜的品质[25,26]。

本研究从实验室自制的萝卜泡菜中分离出7株乳酸菌，其中有1株对藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、植物乳杆菌和单增李斯特菌5株革兰氏阳性菌均具有抑菌性；对沙门氏菌、大肠杆菌和副溶血性弧菌3株革兰氏阴性菌也均具有抑菌性，命名为PY5-7。排除过氧化氢和有机酸的干扰，这类抑菌物质对某些蛋白酶敏感，证明其为蛋白质类物质，确定其为细菌素。PY5-7所产的细菌素耐热性良好，可以在较高温度下仍然具有抑菌活性。热加工是食品加工中最常用的方法，将该细菌素用于食品加工过程中时，热加工技术不会影响其抑菌效果。研究表明：多数小分子细菌素是带正电荷的，其PI值在8～11之间，而且是两性分子，具有亲水性和疏水性，其表达活性的pH范围为3～7之间，它们吸附在革兰氏阳性细菌表面的能力具有pH依赖性[27]。PY5-7所产细菌素在pH值2.0～9.0之间具有稳定的抑菌活性，耐酸碱性良好。

通过API 50CHL糖酵解鉴定以及16S rDNA分析鉴定该菌为植物乳杆菌，命名为LactobacillusplantarumPY5-7。植物乳杆菌是分布最广泛也是在食品中应用最广泛的乳酸菌种之一。植物乳杆菌可产生多种植物乳杆菌素，植物乳杆菌素因其广谱抑菌性，且基因编码较为清晰，近年来受到广泛关注。

细菌素具有安全性、高效性，其添加不改变产品风味，病原菌对其不易产生抗性，而且它可以有效抑制或杀死病原菌，对于人体很安全。筛选具有广谱抑菌性的乳酸菌，将其直接应用于发酵食品加工，或将其产生的细菌素制成生物防腐剂在食品中应用，从而代替传统化学防腐剂的使用，可以大大减少环境污染，增加食品的安全性，具有非常深远的意义。

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