四川麸醋醋醅中乳酸菌的分离鉴定及产酸特性研究

陈卓，毛祥,2，于华，唐平，黄丹，2*，赵长青,2

(1.四川理工学院 生物工程学院，四川 自贡　643000；2.四川省川南晒制麸醋生物酿造技术工程实验室，四川 自贡　643000；3.四川工业科技学院 食品与服装学院，四川 德阳　618500)

四川麸醋是我国一种著名的食醋，主要以麸皮等为原料，采用多菌种、生料固态发酵的传统工艺[1]。它以药曲和黑曲作糖化剂，再加上醋母和麸皮拌和后入池，发酵主要靠环境中的微生物进行，其产品色泽黑褐、味道幽香、酸味柔和、体态澄清、可久存而不腐[2]。在食醋生产过程中，酵母菌、醋酸菌、霉菌、乳酸菌等都是优势菌，是主要的发酵剂[3]。因此，研究乳酸菌的产酸特性可以为后期提高食醋的出醋率奠定基础。目前，对食醋酿造过程中的乳酸菌的研究比较活跃，Xu Wei等[4]在对镇江香醋发酵过程中菌系分布的研究中，发现乳酸菌和醋酸菌占主体地位。Wu Jiajia等[5]在研究山西老陈醋酿造过程中的菌系组成时，发现乳酸杆菌属和魏斯氏菌属是酒精发酵阶段的主要优势微生物。聂志强等[6]采用宏基因组学技术研究天津独流老醋醋酸发酵过程中菌系组成，结果表明：随着发酵的进行，乳酸菌的丰度逐渐降低，但在整个发酵过程中乳酸菌的丰度远高于其他细菌，说明乳酸菌可能对食醋风味形成具有重要作用。2014年赵国忠等从老陈醋酒醅中分离得到1株有利于食醋发酵的乳酸菌，通过菌株协同发酵，添加乳酸菌与未添加乳酸菌的醋醅进行比较，前者乳酸含量提高了2.1倍；发酵结束后，总酸含量前者为6.37 g/100 g，后者为5.36 g/100 g。但是对四川麸醋中乳酸菌的研究报道还比较少，研究麸醋醋醅中乳酸菌的产酸特性可为解析麸醋风味形成原因提供一些帮助。

本研究从四川麸醋醋醅中筛选出产酸能力较强的优势乳酸菌，进行分子鉴定，并对该菌株在不同发酵初始pH、温度以及摇床转速等条件下的产酸能力进行研究，为解决麸醋出醋率低的问题提供帮助。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1试验材料与试剂

醋醅，四川某传统麸醋厂；CaCO3，HCl，NaOH，HOOCC6H4COOK等，以上药品均为分析纯。

1.1.2培养基

1.1.2.1分离培养基(MRS)

葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，吐温80 1 mL，牛肉膏10 g，乙酸钠5 g，酵母膏5 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸锰0.25 g，柠檬酸二铵2 g，硫酸镁0.58 g，琼脂20 g，碳酸钙20 g，蒸馏水1 L。121 ℃灭菌20 min。

1.1.2.2发酵培养基

在分离培养基的基础上不添加琼脂和碳酸钙。

1.1.3仪器与设备

超净工作台、立式自动压力蒸汽灭菌锅、电子天平、恒温培养箱、pH计、摇床、电子显微镜、移液枪、紫外可见分光光度计、电泳仪、凝胶成像系统、PCR仪。

1.2　方法

1.2.1菌株的分离纯化

准确称量25 g醋醅样品，加入到装有225 mL无菌水的锥形瓶中，震荡摇匀。取1 mL接种于MRS液体培养基中，于37 ℃培养24 h，目的是富集菌体。再吸取1 mL富集后的菌液，以10倍浓度法梯度稀释到10-7，然后再选取适当梯度的菌悬液并吸取1 mL于无菌培养皿中[7]，用含有2%碳酸钙的MRS固体培养基浇注[8]，37 ℃培养48 h，观察。依据乳酸菌形态特征和透明圈大小挑取单菌落。把得到的单菌落多次分离纯化，直至获得纯培养，经显微镜观察确定为单菌落后接种到斜面，所得单菌落编号，保藏备用。

1.2.2菌株的复筛

分别将各分离菌株接种到装有100 mL MRS液体培养基的锥形瓶中，于37 ℃培养24 h。再用pH计法测定其总酸，依据总酸的含量来筛选出其中产酸能力较强的菌株。

1.2.3分离菌株的分子生物学鉴定

为了提取分离菌株的DNA，本试验主要采用冻融法[9]。

引物1(27f)：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；引物2(1492r)：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。

PCR反应体系(25 μL体系)：

DdH2O11

10×PCR缓冲液2.5

2.5 mmol/L dNTP2.0

25 mmol/L MgCl21.5

引物11.0

引物21.0

模板DNA5

Taq酶1

反应条件：

① 预变性95 ℃4 min

② 变性95 ℃45 s

③ 退火56 ℃45 s

④ 延伸72 ℃90 s

⑤ 终延伸 72 ℃1 min

重复②，③，④ 步骤35次，后再延伸1 min停止[10]。最后将扩增出的PCR产物进行测序。

1.2.4分离菌株同源性分析

将测序所得序列在NCBI数据库中进行对比，然后再将对比结果相似度在98%以上的DNA序列下载下来，保存为fasta格式，用MEGA6软件对fasta文件进行序列对比，最后制作成系统发育树。根据菌株间的亲缘关系确定所选菌株的种属。

1.3　分离菌株产酸条件研究

1.3.1产酸曲线的测定

在无菌环境下用移液枪移取1 mL种子液到装有100 mL MRS液体培养基的250 mL的三角瓶中，37 ℃下培养。分别在0，4，8，12，16，20，24，28，32 h下测定酸度(以乳酸计，电位滴定法[11])，计算并记录数据。以上述时间作为横坐标、产酸量作为纵坐标，绘制得到分离菌株的产酸曲线，以确定后续试验中测定酸度的培养时间。

1.3.2发酵初始pH对分离菌株产酸能力的影响

接种 1 mL 种子液于初始 pH 分别为 3.5，5.0，6.5，8.0，9.5的100 mL MRS液体培养基中，在37 ℃，140 r/min条件下培养28 h，以未接种的MRS培养基为空白对照，测定总酸，确定最适发酵初始pH。

1.3.3温度对分离菌株产酸能力的影响

接种1 mL种子液于100 mL MRS液体培养基中。分别于31，34，37，40，43 ℃，自然pH下140 r/min培养28 h，以未接种的MRS培养基为空白对照，测定总酸，确定最适温度。

1.3.4转速对分离菌株产酸能力的影响

接种1 mL种子液于100 mL MRS液体培养基中，分别于120，130，140，150，160 r/min，自然pH和最适温度下培养28 h，以未接种的MRS培养基为空白对照，测定总酸，并确定最适转速。

2　结果与分析

2.1　分离菌株鉴定

2.1.1分离菌株初筛

在MRS琼脂培养基中加入2%的碳酸钙做产酸指示，通过浇注平板法培养，挑取透明圈较大的细菌进行划线纯化，最终筛选得到5株产酸细菌，分别编号B1，B2，B3，B4，B5。通过革兰氏染色实验，可知分离菌株均为革兰氏阳性杆菌。

2.1.2分离菌株复筛

将初筛得到的菌株接种到MRS液体培养基中，37 ℃下静止培养24 h，摇匀后取一定量的发酵液测定总酸，结果见图1。

图1　5株菌的产酸结果Fig.1 Acid-producing result of five strains

由图1可知，菌株B2产酸量最高，因此选择菌株B2做后续发酵试验。

2.1.3分离菌株同源性分析

菌株DNA及PCR扩增电泳图分别见图2和图3。

图2　DNA电泳图Fig.2 DNA electrophoretogram

图3　PCR扩增产物电泳图Fig.3 The electrophoretogram of PCR amplified products

由图2和图3可知，菌株B2的DNA电泳图存在一点拖尾的现象。

2.1.4分离菌株系统发育树构建

将测序序列在NCBI数据库中进行对比，然后再将对比结果相似度在98%以上的DNA序列下载下来，保存为fasta格式，用MEGA6软件对fasta文件进行序列对比，构建系统发育树，明确分离菌株的分类地位和系统发育地位，结果见图4。

图4　系统发育树Fig.4 Phylogenetic tree

由图4可知，分离菌株B2为鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillusrhamnosus)。

2.2　分离菌株产酸条件研究

2.2.1分离菌株产酸曲线测定

分离菌株产酸曲线见图5。

图5　菌株的产酸曲线Fig.5 Acid-producing curve of strain

由图5可知，该菌株在32 h的培养中，总酸呈上升趋势，但在28 h后上升平缓，趋于稳定。因此，在后续试验中选择培养28 h后测定总酸。

2.2.2发酵初始pH对分离菌株产酸的影响

pH对分离菌株产酸能力的影响见图6。

图6　pH对菌株产酸能力的影响Fig.4 Effect of pH value on the acid-producing ability of bacteria strains

由图6可知，当培养基初始pH为5.0时，该乳酸菌的产酸量最高，达到1.986 g/dL。当培养基初始pH<5.0时，乳酸菌的产酸能力下降，但不是很明显；当pH在中性或者偏碱性的条件下时，该乳酸菌的产酸能力却快速下降，这表明在酸性条件下可能有利于该菌的生长和发酵产酸。由此可知，因为在麸醋酿造过程中，环境pH基本上是偏酸性的，所以把该菌株用于酿造四川麸醋是可行的，具有依据的。

2.2.3温度对分离菌株产酸的影响

温度对分离菌株产酸能力的影响见图7。

图7　温度对菌株产酸能力的影响Fig.7 Effect of temperature on the acid-producing ability of bacteria strains

由图7可知，温度对于菌株的产酸能力影响较大，环境温度从31～37 ℃时，分离菌株总酸呈上升趋势，含量可达到1.725 g/dL；当温度高于37 ℃时，菌株的产酸能力受到抑制，总酸下降到1.326 g/dL。这是因为温度太高会影响菌株的生长，从而导致总酸含量下降。

2.2.4转速对分离菌株产酸的影响

转速对分离菌株产酸能力的影响见图8。

图8　转速对菌株产酸能力的影响Fig.8 Effect of rotating speed on the acid-producing ability of bacteria strains

由图8可知，当摇床转速在140 r/min左右时，该菌株的产酸能力最强，总酸含量达到1.713 g/dL。当转速低于140 r/min时，总酸含量降低，这是由于供氧量减少不利于该菌株的生长。因为乳酸菌是兼性厌氧型菌株，当转速高于140 r/min时，供氧量增加会影响菌株发酵产酸，导致总酸含量下降，所以该菌株的最适摇床转速为140 r/min。

3　结论

本试验先从四川麸醋醋醅中筛选出

了5株产酸细菌，然后以产酸能力为指标进行复筛，选出产酸能力较强的菌株，并进行同源性分析，最终确定了该菌株为鼠李糖乳酸杆菌(Lactobacillusrhamnosus)。并研究该菌株在不同发酵温度、初始pH、摇床转速下的产酸能力，结果表明该菌株的最佳产酸条件为初始pH5.0，温度37℃，转速140r/min，总酸含量1.986g/dL。

参考文献：

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[2]杨林娥,李婷,杨宇霞,等.中国食醋的历史、现状与对策[J].中国调味品,2013,38(12):114-117.

[3]赵国忠,孙峰宇,姚云平,等.老陈醋酿造过程中乳酸菌筛选及对风味的影响[J].食品工业科技,2014,35(24):159-163.

[4]Xu Wei,Huang Zhiyong,Zhang Xiaojun,et al.Monitoring the microbial community during solid-state acetic acid fermentation of Zhenjiang aromatic vinegar[J].Food Microbiology,2011,32(6):1175-1181.

[5]Wu J J,Ma Y K,Zhang F F,et al.Biodiversity of yeasts,lactic acid bacteria and acetic acid bacteria in the fermentation of "Shanxi aged vinegar",a traditional Chinese vinegar[J].Food Microbiology,2012,30(1):289-297.

[6]聂志强,韩玥,郑宇,等.宏基因组学技术分析传统食醋发酵过程微生物多样性[J].食品科学,2013,34(15):198-203.

[7]于华,黄丹,陈卓,等.四川麸醋醋醅中产酸芽孢杆菌的分离及发酵特性研究[J].中国食品添加剂,2017(1):83-90.

[8]黄丹,刘有晴,于华,等.四川传统发酵肉中乳酸菌的分离及发酵特性研究[J].食品工业科技,2016,37(3):149-159.

[9]黄丹,梁源,左勇,等.酱油发酵酱醅中耐盐乳酸菌的分离筛选及产酸特性[J].食品与生物技术学报,2014,33(6):652-656.

[10]李金璐,王硕,于婧,等.一种改良的植物DNA提取方法[J].植物学报,2013(1):72-78.

[11]GB/T 5009.41-2003,食醋卫生标准的分析方法[S].