山河陈醋生产中酵母菌产酒产酯特性研究

郑树炀，曹彦军，吕玉柱，郝林*

(1.山西农业大学 食品科学与工程学院，山西 太谷　030801；2.山河醋业股份有限公司，山西 和顺　032700)

山河醋业有限公司位于山西省晋中市和顺县阳光占乡阳光占村，其前身为和顺县阳光醋厂。阳光醋厂成立于1978年，是在有几百年酿醋历史的“德盛昌”醋坊的基础上成立的乡镇企业。阳光醋厂出色地传承和发展了和顺醋的传统酿造工艺和技能，在20世纪80年代初期，阳光醋厂的产品销往全国的多个省市，与“水塔”齐名，成为山西老陈醋的代表类产品，后来企业发展缓慢，但仍然坚持将山西老陈醋的传统制作工艺传承了下来。

大曲质量是决定陈醋品质的内在因素[1]。大曲中微生物种类十分复杂，主要包括细菌、霉菌、酵母菌和放线菌[2,3]。由于菌种多，在酿造过程中生成不同的香气成分，构成独特的风味[4]。大曲依靠自然接种，在很大程度上受环境因素的制约[5]，酒化力低，导致产醋率不高。其中酵母菌是老陈醋生产过程中的功能性微生物之一，除了生成醇之外，还代谢生成醛、酸、酮、酯等香气成分，这些物质对食醋的风味品质起着重要的作用[6-8]。从山河陈醋大曲中分离酵母菌，并研究酵母菌特性、产酒能力，可为提高大曲质量提供依据，从而提高醋的品质和生产效率。

1　材料与方法

1.1　材料与试剂

大曲、封罐前的酒醪：山河醋业有限公司；高粱：市售；无水乙醇、硝酸钾、硝酸钠、氢氧化钠、浓硫酸等试剂：均为国产分析纯；淀粉酶(20000 U/g)：山东龙元生物工程有限公司；糖化酶(50000 U/g)：湖南新鸿鹰生物工程有限公司。

YEPD液体培养基：酵母膏1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖2 g，蒸馏水100 mL。YEPD固体培养基：酵母膏1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖2 g，琼脂2 g，蒸馏水100 mL。发酵培养基：酵母膏1 g，蛋白胨2 g，葡萄糖20 g，蒸馏水100 mL。豆芽汁培养基：黄豆芽125 g，蒸馏水1000 mL，煮沸0.5 h，过滤取汁。无氮合成培养基：葡萄糖2 g，磷酸二氢钾0.15 g，七水硫酸镁0.05 g，酵母膏0.02 g，琼脂2 g，蒸馏水100 mL。同化氮源基础培养基：葡萄糖2 g，磷酸二氢钾0.15 g，七水硫酸镁0.05 g，酵母膏0.02 g，琼脂2 g，氮源2 g，蒸馏水100 mL。醋酸钠琼脂固体培养基：葡萄糖0.1 g，氯化钠0.18 g，酵母膏0.25 g，醋酸钠0.82 g，琼脂2 g，蒸馏水100 mL。以上培养基均经过115 ℃灭菌20 min。

1.2　仪器与设备

PR-CJT-4超净工作台上海普瑞斯仪器有限公司；YXQ-LS-50SⅡ型立式压力蒸汽灭菌锅上海博讯实业有限公司医疗设备厂；GNP-9160电热恒温培养箱上海精宏实验设备有限公司；722G可见分光光度计上海精密科学仪器有限公司；Trace ISO气相色谱-质谱联用仪Thermo Fisher公司。

1.3　方法

1.3.1酵母菌株的分离

分别取25 g大曲、酒醪放入装有225 mL无菌水中振荡10 min，静置30 min，取上清液1 mL装入盛有9 mL无菌水的试管中进行梯度逐级稀释，做成10-2～10-7的溶液，吸取各梯度溶液0.2 mL于YEPD固体培养基上涂布均匀，置于30 ℃恒温培养箱中倒置培养48 h。挑取光滑、湿润、粘稠的优势菌落，进一步划线分离纯化后，保藏备用[9-12]。

1.3.2菌株形态鉴定

菌落形态：将菌种接到YEPD固体培养基，于30 ℃恒温培养箱培养48 h，观察菌落表面、形状、颜色、边缘、隆起程度、繁殖方式等。

细胞形态：挑取单菌落均匀涂载玻片上，于高倍镜下观察，记录菌体形状、繁殖方式。

假菌丝形态：将生长旺盛的菌种接到YEPD固体培养基，于30 ℃恒温培养箱培养7天，观察是否有菌丝长出，并在高倍显微镜下观察菌丝形态。

子囊孢子：将生长旺盛的菌种接到醋酸钠琼脂固体培养基，于30 ℃恒温培养箱培养7天，挑取单菌落于载玻片上进行简单染色后在油镜下进行观察。

1.3.3生理生化鉴定

糖发酵实验：用无菌水将测试糖配成10%的溶液，吸取一定量的糖液分装于含有杜氏管的豆芽汁试管中，使糖浓度达到2%。将新鲜菌种接入含有不同糖类的豆芽汁试管中，30 ℃培养，每天观察结果[13]，实验用的糖类有葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉。

氮源同化实验：将测试菌株接种于无氮合成培养基中，于30 ℃饥饿培养7天。然后接入含有不同氮源的同化氮源基础培养基的平板中，混匀后静置，待凝固后置于30 ℃培养3天，观察并记录结果，阳性反应者在培养皿中有酵母菌生长[14]，实验用的氮源有硝酸钾、硝酸钠。

1.3.4酵母菌的生产性能测定

耐酒精性能：分别取0.2 mL菌悬液接种到10 mL酒精度分别为9%，11%，13%，15%，17%的YEPD液体培养基的试管中，混匀后在30 ℃培养1天，以灭菌YEPD液体培养基为对照，用分光光度计测量OD600 nm值，并记录。

产酒、产酯性能：挑取单菌落制备菌悬液，以10%的接种量接种至盛有100 mL发酵培养基的三角瓶中，用8层纱布封口，培养基培养24 h后用塑料薄膜封口。由于塑料薄膜有一定的透气性，每24 h称重1次，测定CO2失重量，并记录。2次称重差值小于0.5 g时视为发酵结束。测定发酵液的酒精度及总酯含量。

酒精度：按照GB/T 10345-2007的蒸馏法。总酯：碱液皂化法[15]。

1.3.5挥发性成分的测定

1.3.5.1发酵液的制备

将高粱粉碎，用65%的水分浸泡4 h，加入3倍的水煮沸1 h，在90 ℃下加入3%的淀粉酶，水浴直至淀粉全部酶解，待温度降至60 ℃下再加入0.5%的糖化酶酶解1 h，按10%的接种量接入酵母菌，有氧培养24 h后保鲜膜封口，无氧发酵7天，采用GC-MS测定挥发性成分[16-21]。

1.3.5.2气相色谱条件

TG-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，不分流，氦气(He)流速：1 mL/min；进样口温度：250 ℃，解吸10 min。起始温度为40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min上升至160 ℃，保持2 min，再以20 ℃/min上升至240 ℃，保持5 min。

1.3.5.3质谱条件

接口温度250 ℃，离子源温度250 ℃，电离方式EI，电子能量70 eV，扫描范围35～500 m/z。

1.3.5.4数据检索

通过计算机对检出的各组分进行检索，以Willey和NIST为检索谱库。

2　结果与分析

2.1　形态学鉴定

从大曲、酒醪中分离得到68株具有典型酵母菌特征的菌株。各组中挑选1株代表菌株，共计12株。分别命名为：LY01，LY12，LY14，LY23，LY27，QY03，QY07，QY13，QY15，QY17，QY18，QY20。其结果表明：菌株QY18繁殖方式为裂殖，其他菌株的繁殖方式均为芽殖；菌株LY01，LY12，LY14，LY27，QY07，QY13，QY18产生子囊孢子，其他菌株均不产生子囊孢子；菌株QY03，QY07，QY13，QY17，QY18，QY20形成假菌丝，其他菌株均没有形成假菌丝。

2.2　生理生化鉴定

糖发酵实验中所有菌株均发酵葡萄糖，均不发酵可溶性淀粉，菌株QY07不发酵蔗糖，菌株QY07，QY18不发酵麦芽糖，菌株QY03，QY17可延迟发酵麦芽糖；氮源同化实验中菌株LY01，QY13均可同化硝酸钾、硝酸钠，菌株LY12，QY03，QY07，QY18，QY20同化硝酸钾，其余菌株均不同化。

综合以上实验，根据酵母菌的形态特征与生理生化特性，Bamit的《酵母菌的特征与鉴定手册》和魏景超的《真菌鉴定手册》[22]，分离所得12株酵母菌鉴定结果为：LY01，QY13为汉逊酵母属(Hansenula)；LY23，QY15为克勒克酵母属(Kloeckera)；LY12，LY14，LY27为酵母属(Saccharomyces)；QY03，QY17，QY20为假丝酵母属(Candida)；QY07为毕赤酵母属(Pichia)；QY18为裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。

2.3　酵母菌的生产性能实验

2.3.1耐酒精性

图1　酵母菌的耐酒精性Fig.1 Ethanol tolerance test of yeast

由图1可知，菌株LY14，LY27，QY15在酒精度为15%时不能生长，菌株LY01，LY12，LY23，QY03，QY17，QY18，QY20在酒精度为13%时不能生长，菌株QY07，QY13在酒精度为9%时不能生长。

2.3.2酵母菌的产酒、产酯能力分析

图2　酵母菌株产酒精能力Fig.2 Alcohol production capacity of yeast strain

由图2可知，菌株LY14，QY15产酒精能力强，产酒精度高于9%；菌株LY23，QY13产酒精能力弱，产酒精度低于6.5%；菌株LY01，LY12，LY27，QY03，QY07，QY17，QY18，QY20产酒精能力差异不显著，产酒精度均在7%～9%之间。

图3　酵母菌株产酯能力Fig.3 Ester production capability of yeast strain

由图3可知，菌株QY13产酯能力突出，总酯含量接近0.8 g/dL；菌株LY14，LY27，QY03，QY07，QY15，QY17，QY20产酯能力低弱，总酯含量接近0.6 g/dL；菌株LY01，LY12，LY23，QY18产酯能力差异不显著，总酯含量高于0.65 g/dL，低于0.75 g/dL。

2.4　挥发性成分的测定

本实验采用GC-MS方法对图3得出的高产酯菌株LY01，LY12，LY23，QY13，QY18的发酵液中的挥发性成分进行分析，以大曲发酵液为对照。根据风味物质的类别分类，通过峰面积归一化法计算出各样品中风味物质的相对含量，色谱图见图4，成分分析见表1。

图4　大曲(A)，LY01(B)，LY12(C)，LY23(D)，QY13(E)，QY18(F)的发酵液挥发性香气成分GC-MS总离子流色谱图Fig.4 Volatile aroma components in fermented liquid of Daqu (A), LY01 (B), LY12 (C), LY23 (D), QY13 (E), QY18 (F) analyzed by GC-MS

表1　不同菌株发酵液香气成分检测结果Table 1 Detection results of aroma components in fermented liquid of different strains

续　表

续　表

注：“*”表示具有食醋特征性风味的物质；“-”表示没有检出。

由表1可知，6种不同发酵液共检测出香气成分84种，其中醇类14种，酯类35种，酸类14种，醛类5种，烷烃类8种，烯烃类2种，酮类3种，杂环类3种；相同成分有11种，包括醇类3种，分别是乙醇、正戊醇、苯乙醇；酯类5种，分别是醋酸异戊酯、正己酸乙酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、壬酸乙酯；醛类、烷烃类、杂环类各1种，分别是乙缩醛、1-(1-乙氧基)戊烷、2-正戊基呋喃。

大曲发酵液中共检测到50种物质，醇类9种，酯类25种，酸类4种，醛类3种，烷烃类5种，烯烃类2种，酮类1种，杂环类1种。其中草酸含量最高，检出5种具有食醋特征性风味的物质，分别是苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸异戊酯、棕榈酸乙酯、2-甲基丁酸[23-26]。

菌株LY01发酵液中共检测到38种物质，醇类10种，酯类14种，酸类5种，醛类4种，烷烃类3种，酮类1种，杂环类1种。其中正戊醇含量最高，检出6种具有食醋特征性风味的物质，分别是苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、醋酸异戊酯、2-甲基丁酸、苯乙醛。

菌株LY12发酵液中共检测到40种物质，醇类11种，酯类15种，酸类7种，醛类2种，烷烃类2种，酮类1种，杂环类2种。其中正戊醇含量最高，检出5种具有食醋特征性风味的物质，分别是苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、醋酸异戊酯、苯乙醛。

菌株LY23发酵液中共检测到36种物质，醇类10种，酯类12种，酸类6种，醛类2种，烷烃类4种，酮类1种，杂环类1种。其中正戊醇含量最高，检出5种具有食醋特征性风味的物质，分别是苯乙醇、醋酸苯乙酯、醋酸异戊酯、2-甲基丁酸、苯乙醛。

菌株QY13发酵液中共检测到36种物质，醇类9种，酯类14种，酸类6种，醛类2种，烷烃类2种，酮类1种，杂环类2种。其中乙酸乙酯含量最高，检出5种具有食醋特征性风味的物质，分别是苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、醋酸异戊酯、2-甲基丁酸。

菌株QY18发酵液中共检测到35种物质，醇类9种，酯类17种，酸类3种，醛类2种，烷烃类3种，杂环类1种。其中正戊醇含量最高，检出7种具有食醋特征性风味的物质，分别是苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、醋酸异戊酯、棕榈酸乙酯、2-甲基丁酸、苯乙醛。

3　结论

本研究从山河陈醋大曲、酒醪中分离得到12株酵母菌，鉴定结果：LY01，QY13为汉逊酵母属(Hansenula)；LY23，QY15为克勒克酵母属(Kloeckera)；LY12，LY14，LY27为酵母属(Saccharomyces)；QY03，QY17，QY20为假丝酵母属(Candida)；QY07为毕赤酵母属(Pichia)；QY18为裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)。其中，菌株QY15，LY14，LY27产酒性能好，其酒精度分别为9.4%，9.2%，8.8%。菌株QY13，QY18产酯性能突出，其总酯含量分别为0.7832，0.6855 g/dL。采用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对6种高粱发酵液中检测出香气成分84种，其中相同成分有11种。6种发酵液分别鉴定出香气物质50种、38种、40种、36种、36种、35种。大曲发酵液中香气成分占总挥发性成分的96.83%，可能因为大曲是自然微生物培养得到的[27]，菌类复杂。菌株QY18发酵液中香气成分占总挥发性成分的99.63%，并检出7种具有食醋特征性风味的物质，分别为苯乙醇、乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、醋酸异戊酯、棕榈酸乙酯、2-甲基丁酸、苯乙醛，相对含量分别为3.86%，22.79%，20.27%，0.07%，0.01%，0.14%，0.01%。

本研究可为陈醋生产的菌种选用及工艺改良提供依据。

参考文献：

[1]弓晓艳,吕利华,武振宇,等.山西老陈醋产酸功能菌研究[J].食品工业科技,2010(2):170-173.

[2]卫春会,黄治国,黄丹,等.高温大曲高产蛋白酶菌株的分离鉴定及其产酶性能研究[J].食品与机械,2014(4):24-29.

[3]苏敬东.传统酿醋过程中醋醅微生物时空动态变化规律研究[J].甘肃科技,2011,27(18):70-71.

[4]张宗舟,张海林,陈志梅.发酵工艺对食醋浑浊影响的研究[J].中国酿造,2006,25(1):12-14.

[5]武晋海.山西老陈醋大曲微生物种类及主要生物活性的研究[D].晋中：山西农业大学,2004.

[6]王媛慧.山西老陈醋大曲中优良酵母菌的分离鉴定及发酵应用研究[D].晋中：山西农业大学,2014.

[7]Lurton L,Snakkers S G,Roulland C,et al.Influence of the fermentation yeast strain on the composition of wine spirits[J].Journal of the Science of Food & Agriculture,1995,67(4):485-491.

[8]Pretorius I S,Lambrechts M G.Yeast and its importance to wine aroma: a review[J].South African Journal of Enology & Viticulture,2000,21:97-129.

[9]刘英丽,李文采,张慧娟,等.传统发酵食品产香酵母菌的筛选及其发酵产香特性研究[J].中国食品学报,2015,15(4):63-70.

[10]韩志双,刘军,黄思敏,等.传统麸醋醋醅中一株产香酵母的筛选鉴定及生长特性研究[J].中国调味品,2013,38(10):41-45.

[11]姜加良.传统酿造糯米酒中酵母菌的筛选及发酵特性研究[J].黑龙江科学,2016(1):24-25.

[12]温洪宇,史进,王璐.发酵醋醅酵母菌的分离、生长特性及分子鉴定[J].中国酿造,2013,32(2):48-52.

[13]郝林.食品微生物学实验技术[M].北京：中国农业出版社,2001.

[14]巴尼特,胡瑞卿.酵母菌的特征与鉴定手册[M].青岛：青岛海洋大学出版社,1991.

[15]余尚华,刘沛龙.白酒中总酯测定方法的研究[J].酿酒,1982(4):35-39.

[16]张丽娟.恒顺香醋醋酸发酵过程中风味物质的变化分析[D].无锡：江南大学,2008.

[17]孙宗保.镇江香醋挥发性成分分析及醋龄的识别研究[D].镇江：江苏大学,2014.

[18]Pizarro C,Esteban-Diez I,Saenz-Gonzalez C,et al.Vinegar classification based on feature extraction and selection from headspace solid-phase microextraction/gas chromatography volatile analyses: a feasibility study[J].Analytica Chimica Acta,2008,608(1):38-47.

[19]Xiao Z,Dai S,Niu Y,et al.Discrimination of Chinese vinegars based on headspace solid-phase microextraction-gas chromatography mass spectrometry of volatile compounds and multivariate analysis[J].Journal of Food Science,2011,76(8):1125-1135.

[20]Yu Y J,Lu Z M,Yu N H,et al.HS-SPME/GC-MS and chemometrics for volatile composition of Chinese traditional aromatic vinegar in the Zhenjiang region[J].Journal of the Institute of Brewing,2012,118(1):133-141.

[21]Morales M L,Gonzalez G A,Casas J A,et al.Multivariate analysis of commercial and laboratory produced sherry wine vinegars: influence of acetification and aging[J].European Food Research & Technology,2001,212(6):676-682.

[22]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.

[23]魏永义,焦驼文,崔广,等.食醋特征香气成分分析研究[J].中国调味品,2010,35(6):99-101.

[24]刘超.优质食醋发酵过程中的风味及安全性研究[D].天津：天津科技大学,2012.

[25]Charles M,Martin B,Ginies C,et al.Potent aroma compounds of two red wine vinegars[J].J Agric Food Chem,2000,48(1):70-77.

[26]孙宝国.食用调香术[M].北京：化学工业出版社,2010.

[27]林祖申.多菌种发酵是提高酱油、食醋质量的重要途径[J].中国酿造,2005,24(6):1-5.