胀袋酱油中产气微生物筛选鉴定及特性研究

秦南南，夏俊芳，沈玉敏，牛晴伟，古丽娜孜，程怡媚

(新疆农业大学 食品科学与药学学院,乌鲁木齐　830052)

酿造酱油主要是用黄豆、小麦作为主要原料，经多种微生物(曲霉、酵母菌和细菌)的联合作用，酿制而成的一种受人们欢迎的调味品，内含氨基酸、糖类、维生素等多种营养物质[1]。这些营养易被多种微生物利用尤其夏季气温高的时候极易发生胀袋，发生产气渗漏现象给产品造成巨大影响。针对上述出现胀袋现象的样品，本研究从新疆某品牌胀袋酱油中筛选出两株能引起胀袋的产气菌株，通过形态学、生理生化、分子生物学手段对其进行种属鉴定，并对菌株的温度、酸碱性、盐度特性进行研究，分析热杀菌时间、防腐剂对产气微生物生长的影响，以期为胀袋酱油中产气菌的研究奠定一定的基础。

1　材料与方法

1.1　主要材料与仪器

1.1.1试验材料

新疆某酱油企业提供的胀袋酱油、正常酱油。

1.1.2试验试剂

营养琼脂培养基、LB肉汤培养基、马铃薯蔗糖培养基、高糖培养基：购于北京奥博星生物技术有限公司；山梨酸钾、苯甲酸钠、氯化钠等(均为分析纯)：购于天津市盛淼精细化工有限公司；革兰氏染色剂、孔雀绿染色剂：天津市科密欧化学试剂开发中心。

1.1.3试验仪器

LRH-280 型生化培养箱上海森信试验仪器有限公司；LDZX-40SCI 型高压灭菌锅上海申安医疗器械厂；722 可见分光光度计上海欣茂仪器有限公司；FE20 plus pH计上海梅特勒-托利多仪器有限公司； DJ100-3 型电子分析天平上海恒平科学仪器有限公司；Nikon E200光学生物显微镜北京瑞科中仪科技有限公司。

1.2　方法

1.2.1多种培养基分离微生物

无菌条件下将正常酱油和胀袋酱油吸取25 mL于225 mL无菌生理盐水中，振摇5～10 min制备菌悬液，在无菌条件下准确吸取不同浓度梯度的菌液0.1 mL，涂布于多种培养基(高糖培养基、营养琼脂培养基、马铃薯蔗糖培养基)表面，同时做空白对照，细菌37 ℃培养，酵母菌、霉菌28 ℃培养，连续2～5天观察，对比胀袋酱油与正常酱油中分离出来的菌落形态，将形态不同、怀疑是产气微生物的菌株进行划线分离、纯化，保存菌株备用。

1.2.2产气微生物的验证

将可疑微生物分别接种到相应的产气验证培养基(选用最贴近酱油营养条件的培养基，酱油原油50 mL，蒸馏水50 mL，pH 5.5，加入杜氏管,115 ℃灭菌20 min)[2]。无菌条件下向灭菌后的产气验证培养基管中加入1 mL的菌悬液，若为细菌，置于37 ℃培养，若为霉菌和酵母菌，置于28 ℃培养,连续观察1～14天，观察小导管中是否有气泡生成，同时用生理盐水做空白对照，若小导管中有气泡生成，再从产气的试管中分离其中的微生物观察其性状并与接种的菌落形态对比，观察是否相同。

1.2.3产气微生物的鉴定

1.2.3.1菌株形态及生理生化鉴定

将验证的产气细菌进行菌落特征、菌体形态(革兰氏染色、芽孢染色)和生理生化实验，参考《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册[3，4]。对于霉菌和酵母，也通过观察菌落形态、菌体形态及生理生化，参考《真菌鉴定手册》来鉴定其株属[5]。

1.2.3.216S rDNA分子生物学鉴定

采用细菌通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，对产气菌株的16S rDNA进行PCR扩增，产物经琼脂糖电泳分离后DNA回收试剂盒割胶回收和纯化，将PCR产物送金唯智生物科技有限公司进行测序，将得到的16S rDNA序列在NCBI-GenBank进行BLAST分析,找到序列最相近的微生物种类,其相似度达96%以上认为是同一种菌[6-8]。

1.2.4产气微生物的耐温性、耐盐性、耐pH的特性分析

将产气菌接种到LB肉汤管中，并使接种后菌浓度达到108cfu/mL，测定在不同温度(4，10，25，30，35，40，45 ℃)、不同盐浓度(0%，3%，5%，7%，9%，11%，13%，15%，17%，19%，21%)及不同初始 pH 值(3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，8.0)下的生长情况，平行3次并设置空白对照管，测定菌液的OD600 nm值。

1.2.5热杀菌时间对产气微生物生长的影响

将产气菌接种到LB肉汤管中，接种后菌浓度达到108cfu/mL。对菌株选用85 ℃和100 ℃的处理温度，处理时间：0，5，10，15，20，25，30 min，LB肉汤于37 ℃培养24 h，每个处理3个平行并设置空白对照，测定菌液的OD600 nm值。

1.2.6防腐剂苯甲酸钠、山梨酸钾对产气微生物生长的影响

GB 2760-2014食品安全国家标准《食品添加剂使用标准》规定苯甲酸钠和山梨酸钾在酱油中的最大使用量是1.0 g/kg，分别设置浓度为0，0.1，0.3，0.5，0.7，1.0 g/kg梯度防腐剂浓度，将制备好的菌悬液接种到含有不同浓度防腐剂的LB肉汤试管中，以接菌但不含防腐剂为对照组，LB肉汤于37 ℃培养24 h后测定菌液的OD600 nm值(每个处理3个平行并设置空白对照)。然后选择合适的防腐剂浓度水平，根据下列公式计算抑菌率：

IR(%)=(k0-k)/k0×100。

式中:IR为抑菌率(%)；k0为不添加防腐剂对照组的菌落数(cfu/mL)；k为添加防腐剂的菌落数(cfu/mL)。

1.2.7模拟杀菌方案对比

准备数支10 mL正常酱油经过121 ℃灭菌30 min确定无菌，人为接种1环产气菌株单菌落，设计4组试验：先加入终浓度为0.7 g/kg的苯甲酸钠再于85 ℃灭菌15 min；先加入终浓度为0.7 g/kg的山梨酸钾再于85 ℃灭菌15 min；先于85 ℃灭菌15 min再加入终浓度为0.7 g/kg的苯甲酸钠；先于85 ℃灭菌15 min再加入终浓度为0.7 g/kg的山梨酸钾，分别在37，4 ℃培养后采用涂布平板法计算菌落数，平行测定3次取其平均值，以无菌水为空白对照。

2　结果

2.1　多种培养基分离微生物

本实验没有分离出酵母菌和霉菌，用营养琼脂培养基分离胀袋酱油K1和正常酱油K2时，可以看到细菌数目有明显差异(见图1)，对比K1，K2分离平板，根据细菌菌落形态的不同，共分离、纯化出 4株细菌菌株，编号为Z1，Z2，Z3，Z4，并于 4 ℃冰箱中用营养琼脂斜面保藏备用，结果见图2，菌落特征见表1。

图1　K1和K2样品营养琼脂培养基分离结果Fig.1 Nutrient AGAR separation results of sample K1 and K2

图2　Z1,Z2,Z3,Z4菌株营养琼脂分离结果Fig.2 Nutrient AGAR separation results of sample Z1, Z2, Z3 and Z4 strains

表1　Z1，Z2，Z3，Z4菌株菌落特征Table 1 Colony characteristics of Z1, Z2, Z3 and Z4 strains

2.2　产生验证结果观察

表2　产气验证实验结果Table 2 Results of gas production verification

续　表

注：“-”代表无产气现象，“+-”代表微弱产气，“+”代表有明显产气，“+”的个数越多代表产气越明显。

由表2可知，接种胀袋酱油样品的3支试管在观察期(1～14天)都有产气现象，且随着天数增多，产气现象越明显；接种Z2，Z3 的试管，在观察期(14天)中未看到产气现象；接种Z1，Z4 的试管，接种1天后试管产气，随着天数增多，产气现象加强；将产气管中的微生物分离于营养琼脂培养基与接种菌株对比，发现菌落形态一致。由此可见，菌株Z1，Z4为导致酱油胀袋的产气微生物，产气现象见图3。

图3　菌株的产气实验结果Fig.3 The gas production results of strains

2.3　产气微生物的鉴定

2.3.1传统鉴定结果

2.3.1.1菌株形态观察

图4　Z1菌株在营养琼脂(A)和LB液体培养基(B)及革兰氏染色形态(C)和芽孢染色结果(D)Fig.4 Morphology of Z1 strain on NA(A),LB liquid medium(B), Gram staining (C) and spore staining(D)

图5　Z4菌株在营养琼脂(A)和LB液体培养基(B)及革兰氏染色形态(C)和芽孢染色结果(D)Fig.5 Morphology of Z4 strain on NA(A),LB liquid medium(B),Gram staining (C) and spore staining(D)

由图4和图5可知，Z1，Z4菌株在营养琼脂培养基的菌落形态见表1，Z1菌株呈不规则圆形性状，同心环膜状，表面质地干燥褶皱，乳白色，底部湿润，无光泽，不透明，Z4菌株呈不规则圆形形状，锯齿状边缘，乳白色，中间凸起，质地较为粘稠且松软，不透明；LB肉汤培养液轻微浑浊，表面有完整菌膜，菌膜呈灰白色；通过革兰氏染色、芽孢染色等结果得出2株菌均为革兰氏阳性芽孢杆菌。

2.3.1.2菌株生理生化特性

产气菌株糖醇发酵实验结果见表3， Z1菌株能发酵葡萄糖、蔗糖、甘露醇并且产酸，Vp反应阴性，明胶液化快，酪素分解迅速，分解硝酸盐。Z4菌株能发酵葡萄糖、麦芽糖、乳糖等多种糖、醇产酸，分解硝酸盐、水解淀粉。参考《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常见细菌系统鉴定手册》，初步鉴定Z1菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，Z4菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

表3　两株菌株生理生化特性Table 3 Biochemical characteristics of two strains

续　表

注：“+”为阳性反应，“-”为阴性反应，“+-”为弱阳性。

2.3.216S rDNA鉴定结果

PCR扩增获得约1500 bp目标产区(见图6)， Z1菌株的16S rDNA序列长度为1420 bp，Z4菌株的16S rDNA序列长度为1415 bp，将得到的序列上传至NCBI-GenBank，进行BLAST同源性检索分析。由表4可知，Z1菌株的16S rDNA与Bacillusmegateriumstrain H3-2菌株的该基因序列的匹配度为1.00，且序列长度最接近，与2.3.1传统方法鉴定的结果一致，故Z1菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)。由表5可知，Z4菌株的16S rDNA与Bacillussubtilisstrain BS-5菌株的该基因序列的匹配度为1.00，且序列长度最接近，与2.3.1传统方法鉴定结果一致，所以Z4菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。

图6　菌株的16S rDNA扩增电泳结果Fig.6 The results of strains' 16S rDNA electrophoresis

注：M表示Maker；1，2,3分别是Z1菌株、Z4菌株、阴性质控。

表4　Z1菌株16S rDNA的BLAST结果Table 4 The BLAST results of 16S rDNA of Z1 strain

表5　Z4菌株16S rDNA的BLAST结果Table 5 The BLAST results of 16S rDNA of Z4 strain

2.4　产气微生物的耐温性、耐盐性、耐pH的特性分析

2.4.1温度对产气菌生长的影响

图7　温度对Z1，Z4 2株菌生长的影响Fig.7 The effect of temperature on the growth of Z1 and Z4 strains

由图7可知，在4，10 ℃培养时，Z1和Z4培养液吸光值几乎为0，说明该温度下菌株生长能力很弱，当在10～30 ℃时，随着温度的升高，Z1，Z4 2株菌快速生长，最适生长温度为36～38 ℃，温度高于40 ℃时，2株菌生长速率减缓但仍能生长，且吸光值均在0.2以上，表明2株菌具有较强耐温性。

2.4.2盐度对产气菌株生长的影响

Z1，Z4 2株菌在含不同盐度的培养基中培养24 h后，测得的菌液OD600 nm的变化值见图8，整体来看，随着氯化钠含量的增加，吸光值逐渐下降，氯化钠含量5%时生长状况较好，Z1，Z4吸光值分别为0.233，0.245，说明2株菌在一定氯化钠浓度范围内，有利于菌体生长，随着盐度的升高，菌体生长能力逐渐减弱，但在15%～21%盐度范围内，菌体仍能缓慢生长，而正常酱油盐含量一般是15%左右，表明2株产气菌有较强耐盐性，可以在酱油环境中存活下来。

图8　盐度对Z1，Z4 2株菌生长的影响Fig.8 The effect of salinity on the growth of Z1 and Z4 strains

2.4.3pH对产气菌株生长的影响

图9　pH对Z1，Z4 2株菌生长的影响Fig.9 The effect of pH on the growth of Z1 and Z4 strains

图10　pH对Z1，Z4 2株菌菌膜形成的影响Fig.10 The effect of pH on the formation of Z1 and Z4 strains' biofilms

由图9，图10可知，在pH 3.5～5.0范围内，Z1，Z4 2株菌生长缓慢，菌液澄清且没有形成菌膜， pH在5.0～7.0时，菌株生长能力随着pH的增大而增大，当pH>5.5时，培养液浑浊且形成菌膜，Z1，Z4 2株菌均在pH值为7.0时有最大吸收值，随着pH>7.0时，菌液OD值逐渐下降，可见2株菌均适合在略酸、偏中性环境下生长，正常酱油pH范围为4.5～5.5，此酸度也适于产气菌株的生长，随着产气菌的生长繁殖新陈代谢，酱油酸度逐渐会增加，引起酱油腐败变质。

2.5　热杀菌时间对产气微生物生长的影响

图11　100 ℃和85 ℃高温处理不同时间对Z1，Z42株菌生长的影响Fig.11 The effect of heat treatment at different time at 100 ℃ and 85 ℃ on the growth of Z1 and Z4 strains

由图11可知，85 ℃对Z1，Z4菌株的处理时间为15 min，菌液浓度变化不大；处理时间由15 min增加到30 min时，菌液浓度下降，但吸光值仍在0.2以上，且随着灭菌时间的延长，菌浓度又开始上升(25～30 min)，可能是因为Z1和Z4菌株的耐热性都较强，当处理温度较低时仍有耐热菌存活，温度适宜又重新繁殖生长。100 ℃时，随着处理时间的增长，菌液吸光值也随之下降，处理25 min时2菌株吸光值几乎接近于0。可见采用85 ℃很难将菌株杀死，采用100 ℃的温度杀菌时至少要处理25 min，才能将Z1，Z4灭活。

2.6　防腐剂苯甲酸钠、山梨酸钾对产气微生物生长的影响

2种防腐剂(苯甲酸钠、山梨酸钾)对Z1，Z4 2株菌株生长的影响，见图12。随着防腐剂浓度的增大，对菌株的抑菌效果也逐渐增强，0.7 g/kg时几乎已观察不到菌膜，对于Z1菌株，0.7 g/kg苯甲酸钠的抑菌效果高于同浓度山梨酸钾9.7%，对于Z4菌株，0.7 g/kg苯甲酸钠的抑菌效果高于同浓度山梨酸钾16.25%，所以苯甲酸钠的抑菌效果要明显优于山梨酸钾的抑菌效果。由于酱油中添加防腐剂的含量不得超过1 g/kg，从安全角度考虑，我们选用0.7 g/kg为最佳浓度，计算抑菌率，苯甲酸钠对2株菌的抑菌率都在99%以上，见表6。

图12　不同浓度防腐剂对Z1，Z4 2株菌生长的影响Fig.12 The effect of different concentration of preservatives on the growth of two strains

表6　0.7 g/kg防腐剂浓度对Z1，Z42株菌生长的影响Table 6 The effect of 0.7 g/kg concentration of preservatives on the growth of two strains

2.7　模拟杀菌方案确定

考虑酱油营养价值，设计4组杀菌试验，结果见表7，表明一旦样品中污染Z1，Z4菌株，结合采用防腐剂和巴氏灭菌并不能完全杀灭，但采用先灭菌再接入防腐剂的方式可以将危害尽可能降低到最低水平，其中苯甲酸钠抑菌效果优于山梨酸钾。

表7　模拟杀菌试验结果Table 7 Test results of bactericidal simulation

3　讨论

在本研究中我们采用平板分离、产气验证、生理生化及分子生物学鉴定出引起酱油涨袋的产气微生物为巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，2株菌在环境中非常常见，虽不是致病菌但生化实验表明2株菌能发酵多种糖类产酸产气，若残存在酱油产品中，在夏季气温高时必引起胀袋，张小丽等[9]从浙江绍兴某厂胀袋酱油中也分离出巨大芽孢杆菌，可见东西地域相差如此远却分离出一致的产气菌株，必须严格控制将其杀灭。同时对2株菌温度、耐盐性及其pH等特性研究，成品酱油普通灭菌很难杀死菌株，本研究采用热处理、防腐辅助结合抑制芽孢杆菌，发现灭菌后添加防腐剂有较好抑菌作用且苯甲酸钠抑菌效果优于山梨酸钾，可以将危害尽可能降低到最低水平，但要想在源头上去除产气菌对酱油生产的危害，只有加强工厂生产环境，对生产的各个环节进行监控，避免二次污染。

参考文献：

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[2]张小丽.胀袋酱油中产气微生物的分离、鉴定与特性研究[D].杭州：浙江工商大学,2015.

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[5]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海:上海科学技术出版社,1979.

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[9]张小丽,蒋予箭,李峰.导致酱油胀袋微生物的分离与鉴定[J].食品与发酵工业,2014,40(7):51-55.