酸和盐胁迫对乳酸菌活性的影响

吕嘉枥，伍金金，周冰洋，罗 潇

（陕西科技大学 食品与生物工程学院，陕西 西安 710021）

乳酸菌能够增强人体免疫力、修复肠粘膜损伤、抗氧化、抑菌、降血脂、降胆固醇、治疗乳腺炎等[1-7]，广泛应用于食品与发酵工业[8-10]，乳酸菌的活性是影响其产品开发与应用的重要因素。研究表明，影响乳酸菌活性的因素有很多，如温度、pH、盐浓度、氧浓度、营养物质等[11-14]。

发酵食品的显著特征是高含盐量，且随着发酵的进行积累大量的酸，所以研究酸和盐胁迫对乳酸菌活性的影响十分重要。王璐[15]对嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）进行耐盐实验，发现盐胁迫对这两株乳酸菌的生长有很大的抑制作用，接着不断地将乳酸菌转接到更高盐浓度的培养基中驯化培养，发现驯化后的乳酸菌能够提高对盐胁迫的耐受性；南晓芳等[16]从豆豉和腐乳中分离并筛选出了5株耐盐性高达12%的乳酸菌，乳酸菌的耐盐特性对于提高豆豉和腐乳的品质有着重要的作用；崔树茂[17]研究了不同浓度的氯化钠、乳酸钠和乙酸钠对乳酸菌生长的影响，结果表明这3种胞外酸根对乳酸菌完全抑制时的浓度相同；施为家[18]研究发现，pH值对乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）营养物质的吸收、胞内酶的活性和有氧呼吸效率等许多细胞生理功能都有十分重要的影响；闫征等[19]分别用乳酸和HCl调节培养初始pH值，研究了不同pH条件下乳酸产量和乳酸菌的生长情况，结果表明，乳酸的逐渐积累是导致乳酸菌的生长和乳酸产量受到抑制的直接原因，而H+浓度的增加（pH降低）则是间接原因；尚天翠[20]和熊素玉等[21]分别从乳制品中分离纯化出10株和24株乳酸菌，研究发现这两次分离纯化的乳酸菌最适pH值都在6.5左右。目前对于酸和盐胁迫条件下乳酸菌活性的影响已有一些报道，但同时研究酸胁迫和盐胁迫对乳酸菌活性的影响报道较少，且大多数研究选取的乳酸菌菌种不够全面，不能进行横向比较。

本研究广泛选取13株食品中常见的乳酸菌，在不同的盐浓度和pH值条件下培养，测定其在不同盐和酸条件下的生长曲线，期望获得每株菌最适的酸和盐生长条件，并进行横向比较，并探索这13株乳酸菌的耐酸、耐盐能力，为乳酸菌更好地应用于食品行业提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试乳酸菌

保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus）（Lb）、嗜酸乳杆菌（Lactibacillus acidophilus）（La）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）（Lc）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）（Lp）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）（Lr）、长双歧杆菌（Bifidobacterium longum）（Bl）、动物双歧杆菌（Bifidobacterium animalis）（Ba）、婴儿双歧杆菌（Bifidobacterium infantis）（Bi）、副干酪乳杆菌（Lactobacillus paracasei）（Lcp）、乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）（Pi）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）（Pp）、乳酸乳球菌乳酸亚种（Lactococcus lactissubsp.）（Ll）和嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）（St）：均由陕西科技大学食品与生物工程学院提供。

1.1.2 培养基

MRS液体培养基[22]：蛋白胨10 g，牛肉膏8 g，酵母膏4 g，葡萄糖20 g，乙酸钠5 g，柠檬酸氢二氨2 g，吐温-80 1 mL，K2HPO42 g，MnSO4·4H2O 0.04 g，MnSO4·7H2O 0.2 g，水1 000 mL。pH值自然，121 ℃高压灭菌15 min。

1.1.3 试剂

蛋白胨、牛肉膏、酵母膏：北京奥博星生物技术责任有限公司；葡萄糖、乙酸钠、柠檬酸氢二氨、吐温-80、K2HPO4、MnSO4·4H2O、MnSO4·7H2O、甲苯胺蓝、氢氧化钠、浓盐酸、醋酸、氯化钠、无水乙醇（均为分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PHS-3C酸度计：上海仪电科学仪器股份有限公司；UV-2600紫外可见分光光度计：尤尼柯上海仪器有限公司；DHP-9080电热恒温培养箱：上海佳胜试验设备有限公司；101-1电热鼓风干燥箱：北京科伟永兴仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌菌种的活化

将MRS液体培养基加入厌氧管中，从固体斜面培养基将供试乳酸菌接种到MRS液体培养基中，37 ℃活化培养48 h，甲苯胺蓝染色[23]，镜检，无杂菌后二次活化，4 ℃冰箱保存备用[24]。

1.3.2 乳酸菌生长曲线的测定

将活化好的乳酸菌分别以1%（V/V）的接种量接种到MRS液体培养基中，37 ℃静置培养72 h，分别在培养0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h取样，以未接种的MRS液体调节零点，在波长为600 nm处测定样品的OD600nm值。以OD600nm值为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制乳酸菌的生长曲线。

1.3.3 盐胁迫对乳酸菌生长的影响

MRS液体培养基中分别添加1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的NaCl，将活化好的乳酸菌分别以1%（V/V）的接种量接种到不同盐浓度的MRS液体培养基中，37 ℃静置培养72 h，分别在培养0 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h时取样，以未接种的MRS液体调节零点，在波长600 nm处测定样品的OD600nm值，绘制乳酸菌的生长曲线。

1.3.4 酸胁迫对乳酸菌生长的影响

用1 mol/L HCl溶液将MRS液体培养基的pH值分别调为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，再用1 mol/L NaOH溶液将MRS液体培养基的pH值调为7.0。取活化好的乳酸菌分别以1%（V/V）的接种量接种于不同pH值的MRS液体培养基中，37 ℃静置培养168 h，分别在培养0 h、4 h、8 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、96 h、120 h、144 h、168 h时取样，以未接种的MRS液体调节零点，在波长600 nm处测定样品的OD600nm值，绘制乳酸菌的生长曲线。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌的生长曲线

图1 13株乳酸菌的生长曲线Fig.1 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria

由图1可知，13株乳酸菌在MRS液体培养基中生长良好，其中乳酸菌Pi和Pp迟缓期为4 h，乳酸菌Lp、Lc、Lcp迟缓期为8 h，乳酸菌Lr、Ll和St迟缓期为12 h，乳酸菌Lb、La、Bl、Bi和Ba迟缓期为20 h，进入对数期后，13株乳酸菌的活菌数均直线上升，36 h后所有乳酸菌到达稳定期，并且在稳定期，OD600nm值一直保持较高水平，72 h内没有进入衰亡期。到达稳定期时乳酸菌Lb和La的OD600nm值低于另外11株菌，说明自然状态下乳酸菌Lb和La活性低于其他11株菌。

2.2 盐胁迫对13株乳酸菌生长的影响

图2 1%盐浓度时13株乳酸菌的生长曲线Fig.2 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 1%

由图2可知，盐浓度为1%时，乳酸菌Lp和Lcp的迟缓期为4 h，乳酸菌Lc、Pp和Pi的迟缓期为8 h，乳酸菌Lb、Ll、St、La和Lr的迟缓期为12 h，乳酸菌Bi、Bl和Ba的迟缓期为20 h，乳酸菌Lp、Lcp、Lb、La的迟缓期比不加盐时的短，且到达稳定期时乳酸菌Lp、Lcp、Lb、La的OD600nm值高于不加盐时稳定期的OD600nm值，表明盐浓度为1%时有利于乳酸菌Lp、Lcp、Lb、La的生长。

图3 2%盐浓度时13株乳酸菌的生长曲线Fig.3 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 2%

由图3可知，盐浓度为2%时，乳酸菌Lcp和Lp的迟缓期为4 h，乳酸菌Lr、Pi、Pp和Lc的迟缓期为8 h，乳酸菌St和Ll迟缓期为12 h，乳酸菌Ba和La的迟缓期为16 h，乳酸菌Bl和Lb的迟缓期为20 h，乳酸菌Bi的迟缓期为24 h，说明盐浓度为2%有利于缩短乳酸菌Lp、Lcp、Lr、La、Ba的生长迟缓期，促进这5株菌的前期生长；到达稳定期时乳酸菌Lc的OD600nm值低于其他12株菌，说明盐浓度为2%时乳酸菌Lc对盐胁迫更敏感；乳酸菌Lb及La的稳定期OD600nm值同样高于不加盐时的稳定期OD600nm值，且高于盐浓度为1%时的稳定期OD600nm值，说明盐浓度为2%进一步促进了乳酸菌Lb、La的生长。

图4 3%盐浓度时13株乳酸菌的生长曲线Fig.4 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 3%

由图4可知，盐浓度为3%时增加了乳酸菌Pi、Pp、Lr、Lc、La、Bi、Ba、Lb的生长迟缓期，抑制了这8株菌的前期生长；到达稳定期时除了乳酸菌Lb和La，其余11株乳酸菌的生长都受到了抑制，且乳酸菌Lc和Pi的稳定期OD600nm值低于其他11株菌，说明盐浓度为3%时乳酸菌Lc和Pi对盐胁迫更敏感。

图5 4%盐浓度时13株乳酸菌的生长曲线Fig.5 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 4%

由图5可知，盐浓度为4%时增加了乳酸菌Lb、Pi、Pp、Lr、Lc、La、Bi、Bl、Ll、St的生长迟缓期，抑制了这10株菌的前期生长；到达稳定期时除了乳酸菌Lb和La，其余11株乳酸菌的生长都受到了抑制，乳酸菌Pi和Ll的OD600nm值较其他11株菌低，且乳酸菌Pi最早进入衰亡期，说明盐浓度为4%时乳酸菌Pi和Ll对盐胁迫更敏感。

由图6可知，盐浓度为5%时增加了乳酸菌Lb、Pi、Pp、Lr、Lc、La、Bi、Bl、Ba、Ll、St的生长迟缓期，抑制了这11株菌的前期生长；到达稳定期时除了乳酸菌La，其余12株乳酸菌的OD600nm值都低于不加盐时的OD600nm值，说明盐浓度为5%抑制了这12株乳酸菌的生长。

由图7可知，盐浓度为6%时增加了乳酸菌Lb、Pi、Pp、Lr、Lc、La、Bi、Bl、Ba、Ll、St的生长迟缓期，抑制了这11株菌的前期生长；到达稳定期时除了乳酸菌La，其余12株乳酸菌的生长都受到了抑制，Lcp、Pi和Ll的OD600nm值较其他乳酸菌低，说明盐浓度为6%时乳酸菌Lcp、Pi和Ll对盐胁迫更敏感。

图6 5%盐浓度时13株乳酸菌的生长曲线Fig.6 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 5%

图7 6%盐浓度时13株乳酸菌的生长曲线Fig.7 Growth curves of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 6%

图8 7%盐浓度时13株乳酸菌的生长曲线Fig.8 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 7%

由图8可知，除了乳酸菌Lcp，其余12株菌的迟缓期都显著增加，盐浓度为7%抑制了这12株菌的前期生长；到达稳定期时13株乳酸菌的OD600nm值都低于不加盐时的OD600nm值，说明盐浓度为7%抑制了这13株乳酸菌的生长。

由图9可知，盐浓度为8%对这13株乳酸菌的整个生长过程都有抑制作用，且对乳酸菌Lcp、Lp、Pi、Pp、Lr、Ll、St的生长抑制率＞50%，对乳酸菌La、Bi、Bl、Ba、Lb、Lc的生长抑制率＞95%。

由图10可知，盐浓度为9%对这13株乳酸菌的生长有显著抑制作用，且对乳酸菌Lcp、Pi、St、Pp、Ll的生长抑制率＞70%，对其余8株乳酸菌的生长抑制率＞95%。

图9 8%盐浓度时13株乳酸菌的生长曲线Fig.9 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 8%

图10 9%盐浓度时13株乳酸菌的生长曲线Fig.10 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 9%

图11 10%盐浓度时13株乳酸菌的生长曲线Fig.11 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria with salt concentration 10%

由图11可知，盐浓度为10%时，乳酸菌Lcp在第8小时开始缓慢生长，在第36小时时进入稳定期，最终稳定期OD600nm值为0.165，中间没有出现明显的对数生长期，OD600nm值维持在0.1左右；乳酸菌Pi、Pp、St及Ll在48 h后开始生长，72 h后进入稳定期，最大OD600nm值为1.053；其余8株菌直至测定结束OD600nm值没有显著变化，接近于零。说明盐浓度为10%对这13株乳酸菌的生长有显著抑制作用，且除了乳酸菌Pi、Pp、St、Ll，其余9株乳酸菌的生长抑制率都＞95%，高盐浓度对9株杆菌的抑制作用强于4株球菌。

2.3 酸胁迫对13株乳酸菌生长的影响

图12 pH=1时13株乳酸菌的生长曲线Fig.12 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=1

图13 pH=2时13株乳酸菌的生长曲线Fig.13 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=2

图14 pH=3时13株乳酸菌的生长曲线Fig.14 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=3

由图12～14可知，pH=1～3时，13株乳酸菌都不能明显的生长，OD600nm值一直维持在较低水平，最大不超过0.3，其中4株球菌的OD600nm值高于9株杆菌，说明高酸条件对9株杆菌的抑制作用强于4株球菌；12～24 h是9株杆菌的对数生长期，24 h后OD600nm值基本维持在0.1左右。原因是培养基中所加乳酸的量过多，抑制了乳酸菌本身发酵产乳酸的过程，另一方面，pH值过低本身就不利于乳酸菌继续生长。

由图15可知，pH=4时，长势较好的前3株菌依次是乳酸菌Lcp、Lr、Pi，其中，乳酸菌Lcp的迟缓期为12 h，最终稳定期OD600nm值为2.510，乳酸菌Lr在第48小时进入对数期生长，最终稳定期OD600nm值为2.256，乳酸菌Pi也在第48小时进入对数生长期，最终稳定期OD600nm值为1.983，这3株菌直到测定结束的168 h内并未出现衰亡期，说明这3株乳酸菌在酸胁迫开始解除时最先生长。乳酸菌Lb和La在96 h后显著生长，最大OD600nm值为1.192，说明pH=4对乳酸菌Lb和La的前期生长仍有抑制作用，直到适应pH条件后活菌数开始上升，但仍未达到自然条件下的活菌数。其余8株菌迟缓期为24 h，此后缓慢生长，在144 h后都进入了稳定期，且最终稳定期OD600nm值都比较低，说明pH=4对这8株乳酸菌的生长仍有抑制作用。

图15 pH=4时13株乳酸菌的生长曲线Fig.15 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=4

图16 pH=5时13株乳酸菌的生长曲线Fig.16 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=5

由图16可知，pH=5时，乳酸菌Pi和Pp的迟缓期为8 h，乳酸菌Lc、Lp、Lcp和Lr的迟缓期为12 h，乳酸菌La的迟缓期为36 h，其余6株菌的迟缓期为24 h，13株乳酸菌在48 h后都进入了稳定期，且稳定期OD600nm值都维持在较高水平，说明13株乳酸菌在测定结束时都长势良好。

由图17可知，pH=6时，乳酸菌Lcp、Pi和Pp的迟缓期为4 h，其余10株菌的迟缓期分别在8 h、12 h和24 h，之后进入对数期，OD600nm值显著增大，在36 h后都进入了稳定期且稳定期OD600nm值都维持在较高水平，说明pH=6时13株乳酸菌都长势良好；乳酸菌Lb、La、Lc、Lr、Lp、Bl、Bi、Ba、Lcp、Pp、St的最终稳定期OD600nm值都高于pH=5时的最终稳定期OD600nm值，说明pH=6时这11株乳酸菌的活性高于pH=5。

图17 pH=6时13株乳酸菌的生长曲线Fig.17 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=6

图18 pH=7时13株乳酸菌的生长曲线Fig.18 Growth curve of 13 strains of lactic acid bacteria at pH=7

由图18可知，pH=7时，乳酸菌Lr、Lp、Lc及Lcp在24 h时已进入稳定期，乳酸菌Pi、St、Ll和Pp在36 h时基本进入稳定期，其余5株乳酸菌在48 h后进入稳定期，13株乳酸菌的稳定期OD600nm值都维持在较高水平，说明培养期间13株乳酸菌的长势良好；乳酸菌Lb、La、Lc、Lr、Lcp、Pi、Li、Pp、St的最终稳定期OD600nm值都低于pH=6时的最终稳定期OD600nm值，说明pH=7时这9株乳酸菌的活性低于pH=6。

3 结论

适当的低盐浓度（1%、2%）对部分乳酸菌的生长有促进作用，植物乳杆菌和副干酪乳杆菌的最适盐浓度为1%，保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌的最适盐浓度为2%；盐浓度进一步增大，13株乳酸菌的生长受到抑制；盐浓度为10%时，13株乳酸菌的生长受到明显的抑制作用，除了戊糖片球菌、乳酸片球菌、嗜热链球菌及乳酸乳球菌乳酸亚种，其余9株乳酸菌的生长抑制率都＞95%。当pH值为5～7时，13株乳酸菌均生长良好；当pH=6时，7株乳酸菌活性最高；随着酸胁迫的增强，13株乳酸菌生长受抑制程度增大；当pH值为1～3时，13株乳酸菌的生长抑制率都＞90%。随着酸和盐胁迫作用增强，乳酸菌生长的抑制程度逐渐增大，且高盐、高酸条件对9株杆菌的抑制作用强于4株球菌。通过研究酸和盐胁迫对乳酸菌活性的影响，为进一步开发利用乳酸菌资源提供一定的科学依据。