多菌种固态发酵玉米黄粉饲料种曲的制备条件研究

江成英 ， 王 松 ， 李 琰 ， 徐婷婷 ， 张文学 ， 韩国栋 ， 姜未公

（1.齐齐哈尔大学食品与生物工程学院，黑龙江齐齐哈尔161006；2.齐齐哈尔大学农产品加工黑龙江省普通高校重点实验室，黑龙江齐齐哈尔161006）

目前，运用微生物发酵生产蛋白饲料越来越受到重视。饲料种曲能为菌种提供良好的生长环境，使其大量繁殖，利于发酵底物能够更好更快的发酵。玉米黄粉是湿法生产玉米淀粉的下脚料，虽然其中所含蛋白质水溶性差，直接做为饲料动物的消化利用率低，但其可做为一种生产发酵蛋白饲料的良好基质 （赵文扬等，2015；贾祥祥等，2011）。本研究以玉米黄粉为基质，主要从麸皮添加量、加水量、混合菌种的接种量、制曲温度和制曲时间五个方面进行单因素试验，并设计正交优化试验，最终确定多菌种固态发酵玉米黄粉饲料种曲的制备条件。

1　材料与方法

1.1主要材料 热带假丝酵母、纳豆芽孢杆菌、

枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜热乳杆菌由齐齐哈尔大学生物工程实验室保藏；玉米黄粉由中粮生化能源（龙江）有限公司提供；麸皮为市售。

1.2主要试剂 葡萄糖、琼脂、胰蛋白胨、氯化钠、酵母粉、磷酸氢二钾等试剂均为国产分析纯。

1.3主要仪器 隔水式电热恒温培养箱，显微镜，全温振荡器，超净工作台，血球计数板等。

1.4试验方法

1.4.1活菌总数的测定 种曲中活菌总数的测定采用平板活菌计数法（胡明等，2013）。

1.4.2单因素试验 将所用五种菌以一定的比例（枯草芽孢杆菌∶热带假丝酵母菌∶嗜热乳杆菌∶纳豆芽孢杆菌∶地衣芽孢杆菌=3∶3∶1∶4∶2）混合，接种于种曲制备培养基中进行种曲的制备，通过测定活菌总数研究种曲的制备条件。

1.4.3正交试验设计 根据单因素试验结果，对种曲制备的麸皮添加量、加水量、混合菌种的接种量、制曲温度和制曲时间设计五因素四水平L16（45）的正交优化试验，以确定多菌种固态发酵玉米黄粉饲料种曲制备的条件。

2　结果与讨论

2.1单因素试验

2.1.1麸皮添加量对制曲的影响 玉米黄粉持水性差，加水后易黏结，使制曲物料透气性不好从而影响菌种的呼吸，通过添加麸皮可改善其疏松度。本研究以玉米黄粉为基质，分别添加30%、40%、50%、60%、70%、80%的麸皮并加入1.2倍的水配制种曲培养基，接入5%的混合菌种，在30℃条件下培养72 h后取样测定种曲中的活菌总数，确定麸皮添加量。结果如表1所示。

表1　不同麸皮添加量对种曲中活菌总数的影响

由表1可知，随着麸皮添加量的不断增加，种曲中的活菌总数也不断增加，当麸皮添加量达到70%时，活菌总数达到最大，随后略有降低。主要原因是由于麸皮含量的提高使种曲的疏松度变好，适宜微生物的生长，但过高的麸皮含量使培养基中氮源不足，而导致菌体繁殖量减少。 因此确定麸皮添加量为70%。

2.1.2加水量对制曲的影响 水分活度是影响微生物生长的重要因素之一，培养底物中的水分含量决定着微生物的生长状态。以玉米黄粉为基质，添加70%的麸皮配制种曲培养基，分别加入1、1.2、1.4、1.6、1.8 倍的水， 接入 5%的混合菌种，在30℃条件下培养72 h后取样测定种曲中的活菌总数，确定加水量。结果如表2所示。

表2　不同加水量对种曲中活菌总数的影响

由图2可知，随着水分含量的增加种曲的微生物总数也不断增加，当料水比为1∶1.6时微生物总数达到最大，为11.73×108cfu/g，之后再增大水分含量，则有所下降。由此可以看出，培养基水分含量过低使得基质膨胀率降低，水分活度降低，从而抑制微生物的生长繁殖；而随着水分含量的增加会使得培养基物料颗粒膨胀，空隙加大，有利于菌体从培养基中获得营养和氧的传递，从而促进生长繁殖；但过高的水分含量会导致培养基黏结成团，多孔性降低，影响氧的传递进而使微生物生长能力降低。因而确定加水量为1.6倍。

2.1.3温度对制曲的影响 以玉米黄粉为基质，添加70%的麸皮并加入1.6倍的水配制种曲培养基，接入 5%的混合菌种，分别在 26、28、30、32、34 ℃条件下培养72 h后取样测定种曲中的活菌总数，确定制曲温度。结果如表3所示。

表3　不同制曲温度对种曲中活菌总数的影响

由表3可知，在制曲过程中随着温度的升高活菌总数逐渐增高，在温度为32℃时，种曲的活菌总数达到最大；随着温度继续升高34℃时，活菌总数略有下降。说明温度对微生物的生长起着很重要的作用，温度低则菌种生长缓慢，而温度过高会破坏菌体内一些酶的活性，从而影响甚至杀死微生物。因此确定32℃为制曲温度。

2.1.4培养时间对制曲的影响 微生物的生长及代谢产物的合成与培养时间密切相关。本试验以玉米黄粉为基质，添加70%的麸皮并加入1.6倍的水配制种曲培养基，接入5%的混合菌种，在32℃条件下进行种曲的制备。以培养时间24 h为起点，每隔12 h对种曲中的活菌总数进行检测，以确定种曲的制备时间。结果如表4所示。

表4　种曲菌落总数随制备时间的变化

由表4可知，在前48 h，微生物处于调整期，新接入的菌种需要适应新的生长环境而导致菌种生长缓慢；48 h之后，微生物处于生长期，到84 h达到稳定期，活菌总数达到最高；而后菌种逐渐进入平衡后期及衰退期，活菌总数逐渐降低。所以选择84 h为种曲的制备时间。

2.1.5接种量对制曲的影响 以玉米黄粉为基质，添加70%的麸皮并加入1.6倍的水配制种曲培养基，分别接入1%、2%、3%、5%、10%的混合菌种，在32℃条件下培养84 h后取样测定种曲中的活菌总数，确定混合菌种的接种量。结果如表5所示。

表5　不同接种量对种曲活菌总数的影响

由表5可知，种曲中的活菌总数随着接种量增加而增大。当接种量为3%～4%时，种曲中的活菌总数增幅最大；为4%～5%时，种曲中的活菌总数增幅虽有所减小但数量亦有明显的增加；但当接种量为10%时种曲中活菌总数与5%相比并无明显增加。由于接种量的加大会增加原料的成本，所以选择5%为种曲制备的接种量。

2.2正交试验结果分析 通过单因素试验得出，制备种曲的条件是以玉米黄粉为基质，添加70%的麸皮并加入1.6倍的水配制种曲培养基，接入5%的混合菌种，在32℃条件下培养84 h。在此基础上设计了五因素四水平L16（45）的正交试验，对各因素组合进行优化。正交试验设计和试验结果如表6所示。

由表6中极差分析可以看出：RB＞RC＞RE＞RA＞RD，可知各因素对种曲制备的影响大小依次为加水量、接种量、制曲温度、麸皮添加量和制曲时间。

由各水平的均值可得：加水量（B）中 K3＞K2＞K4＞K1；接种量（C）中 K3＞K4＞K2＞K1；制曲温度（E）中 K2＞K3＞K1＞K4；麸皮添加量（A）中 K1＞K3＞K4＞K2；制曲时间（D）中 K3＞K1＞K2＞K4。 由此得出，采用混合菌种制备发酵玉米黄粉饲料种曲的最佳条件为B3C3E2A1D3，即：以玉米黄粉为基质，添加80%的麸皮并加入1.6倍的水配制种曲培养基，接入5%的混合菌种，在30℃条件下培养84 h。

3　结论

以多菌种组合进行固态发酵玉米黄粉饲料的种曲制备，通过单因素及正交试验确定最佳制曲工艺条件为：以玉米黄粉为基质，添加80%的麸皮并加入1.6倍的水配制种曲培养基，接入5%的混合菌种，在30℃条件下培养84 h。制备的种曲可用于发酵玉米黄粉生产蛋白饲料。

表6　正交试验设计与结果

[1]胡明，侯乐海，王九菊，等.EM菌固态发酵生产米糠微生态产品的工艺优化[J].粮食与饲料工业，2013，6：42 ～ 45，50.

[2]贾祥祥，郭兴凤.玉米蛋白粉的应用研究进展[J].粮食加工，2011，2：60 ～ 67.