丁酸梭菌缓解仔猪应激防御大肠杆菌病

邢 帅， 朱 琪 ， 梁东梅 ，3， 王柳懿 ，3， 张迪 ，4， 秦顺义 ， 乔家运， 王文杰*

（1.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津300384；2.天津市畜牧兽医研究所，天津300381；3.天津师范大学生命科学学院，天津300387；4.河北农业大学动物医学院，河北保定071000）

随着规模化、集约化养猪业的快速发展，仔猪21日龄断奶已经成为猪场常规饲养管理的一部分。由于早期断奶，仔猪生理各个方面发育的不健全，抵抗外界的能力较差，容易受到疾病、环境和营养等应激因素的影响，导致仔猪食欲降低、消化不良、腹泻、生长缓慢和抗病力差等问题，严重的甚至死亡，直接影响断奶仔猪的增重和成活率，并影响整个饲养期的生长速度和饲料转化率。饲料中添加益生菌可以改善仔猪的生产性能、提高三碘甲状腺原氨酸、胰岛素和甲状腺素含量（高印等，2016)，缓解各种应激带来的不利影响。

丁酸梭菌（Clostridium butyricum）又名丁酸梭状芽孢杆菌、酪酸梭菌，是芽孢杆菌科、梭菌属的一种产丁酸、乳酸和乙酸，革兰氏阳性厌氧杆菌。Liao等 （2015）研究表明丁酸梭菌是重要的益生菌。丁酸梭菌能促进有益菌的生长，抑制有害菌生长繁殖，维持肠道菌群的稳定 （Nakajima等，1997），提高肠道屏障维护肠道健康 （Xu等，2013）。丁酸梭菌还具有营养、防癌、抗肿瘤、抗炎、增强机体免疫力、改善动物生长性能、改善动物产品品质、提高机体免疫力的作用（王腾浩，2015）。研究表明，添加丁酸梭菌可有效提高日增重和饲料转化率。Hayakawa等（2016）研究表明，添加丁酸梭菌可降低腹泻率，刘秋玲等（2016）进行了大肠杆菌对小鼠诱导免疫应激模型建立成功，李海花等（2017）研究表明大肠杆菌可以诱导仔猪发生炎症，但现在关于丁酸梭菌对大肠杆菌感染断奶仔猪的生产性能、血清生化指标、抗应激能力的影响的研究报道较少。因此，本试验通过在断奶仔猪日粮中添加0.05%丁酸梭菌来探讨其对大肠杆菌感染断奶仔猪抗应激能力的影响，为丁酸梭菌在仔猪生产中的应用提供理论依据。

1　材料与方法

1.1试验材料 丁酸梭菌（冻干粉）购自洛阳瑞莱生物工程有限公司，活菌总数为1×1010cfu/g。基础饲料购自于天津通和饲料有限公司，按照NRC（2012）标准设计玉米-豆粕型饲料进行配制。

1.2试验动物与设计 选取（21±2）日龄健康“东北民猪×巴克夏”断奶仔猪20头，随机分为4组，每组5头仔猪，标记为对照组、试验Ⅰ组、试验Ⅱ组和试验Ⅲ组。对照组和试验Ⅰ组为基础日粮组，试验基础饲料的组成和营养水平见表1，试验Ⅱ组和试验Ⅲ组为丁酸梭菌组，在基础日粮中添加了0.05%的丁酸梭菌，活菌总数为1×1010cfu/g。试验为期15 d，每头仔猪为单笼饲养，自由饮水和采食，湿度为55%～70%，温度为25～28℃。在试验进行到第14天的时候进行断料不断水，试验Ⅰ组和试验Ⅲ组攻毒大肠杆菌。24 h后进行采血，分离血清进行检测。

表1　基础日粮组成及营养水平

1.3检测指标 试验在第1天和第15天时分别对仔猪空腹称取初重和末重，每天记录每头仔猪的吃料、腹泻、精神等情况。在饲养的第14天时进行断料不断水进行饲喂，饲养的第15天，进行前腔静脉采血，分离血清，在4℃下6000 r/min离心5 min，取上清液分装于5 mL的离心管中，置-80℃的低温冰箱保存，测定血清中的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰基转移酶（GGT）、谷草/谷丙（AST/ALT）、尿素（UREA）、肌酐（CREA）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLOB）、白蛋白/球蛋白（A/G）以及乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）、皮质醇（CORT）、血糖（GLU）含量。

1.4检测方法 谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、 碱性磷酸酶 （ALP）、γ-谷氨酰基转移酶（GGT）、乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）用速率法，总蛋白（TP）用双缩脲法，白蛋白（ALB）用溴甲酚绿法，尿素（UREA）脲酶紫外速率法，皮质醇（CORT）用电化学发光法，肌酐（CREA）用苦味酸法，仪器用罗氏601型生化仪进行分析。

1.5数据统计分析 试验数据用Excel软件录入，然后用SPSS 20.0软件进行数据的单因素方差分析（one-way ANOVA)，结果用“平均值±标准差”表示，P＞0.05表示差异不显著，p＜0.05表示差异显著，p＜0.01表示差异极显著。

2　结果与分析

2.1丁酸梭菌对断奶仔猪生产性能的影响 从表2可以得出丁酸梭菌组与基础日粮组相比平均日增重和平均日采食量分别提高为39.03%和31.13%，差异显著（p＜0.05）。料重比有所下降，但效果不显著（P＞0.05），腹泻率明显降低。

表2　丁酸梭菌对断奶仔猪生产性能的影响

2.2丁酸梭菌对断奶仔猪血清指标的影响 由表3可知，对照组、试验组Ⅰ、试验组Ⅱ和试验Ⅲ组总蛋白、白蛋白、球蛋白和白球比各组间差异不显著（P＞0.05）。总蛋白丁酸梭菌组与基础日粮组相比呈现上升的趋势；对照组、试验组Ⅰ、试验组Ⅱ和试验组Ⅲ相比白蛋白变化不显著；丁酸梭菌组与基础日粮组相比，球蛋白呈现上升的趋势；白球比丁酸梭菌组与基础日粮组相比呈下降的趋势。对照组、试验组Ⅰ、试验组Ⅱ和试验组Ⅲ的谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰基转移酶、肌酐、尿素含量差异都不显著（P＞0.05）。

表3　丁酸梭菌对断奶仔猪血清指标的影响

2.3丁酸梭菌对断奶仔猪抗应激能力的影响从表4可知，乳酸脱氢酶试验组Ⅰ与对照组相比呈上升的趋势，试验组Ⅲ与试验组Ⅱ相比升高39.95%，差异极显著（p＜0.01），试验组Ⅲ与试验组Ⅰ相比升高41.20%，差异极显著（p＜0.01），试验组Ⅱ和对照组相比差异不显著 （P＞0.05）。肌酸激酶试验组Ⅰ与对照组相比升高，试验组Ⅱ与对照组相比降低24.42%，差异显著（p＜0.05），试验组Ⅲ与试验组Ⅱ相比升高，试验组Ⅲ与试验组Ⅰ相比降低22.45%，差异显著（p＜0.05）。皮质醇试验组Ⅰ与对照组相比降低，试验组Ⅱ与对照组相比升高，试验组Ⅲ与试验组Ⅰ相比升高，试验组Ⅲ与试验组Ⅱ相比降低。血糖试验组Ⅰ与对照组相比升高，试验组Ⅱ与对照组相比降低，试验组Ⅲ与试验组Ⅰ相比升高，试验组Ⅲ与试验组Ⅱ相比升高44.60%，差异显著（p＜0.05）。

表4　丁酸梭菌对断奶仔猪抗应激能力的影响

3　讨论

3.1丁酸梭菌对断奶仔猪生长性能的影响 丁酸梭菌能够产生乙酸、丁酸和乳酸，其能有效抑制肠道有害菌的生长繁殖，同时能够促进肠道有益菌比如双歧杆菌、乳酸杆菌的生长繁殖，稳定肠道微生态平衡。在生产实践中，丁酸梭菌的应用已经取得了显著的效果，其能够提高动物的抵抗力，减少动物的死亡，提高动物的生产性能和经济效益（黄俊，2012）。 张秀江等（2015）研究发现，仔猪断奶后日粮中添加丁酸梭菌，试验组的腹泻率极显著低于对照组（p＜0.01）。张彩云等（2009）研究发现，在断奶仔猪的日粮中添加丁酸梭菌，有利于提高平均日增重，饲料的转化率得到改善，腹泻率也有所降低。孔祥书等（2012）研究发现，丁酸梭菌能够提高日增重、降低料重比、改善生产性能。李玉鹏等（2017）研究发现，添加丁酸梭菌料重比降低，平均日增重提高。这些与本试验的结果相一致，添加丁酸梭菌提高了平均日增重和平均日采食量，降低了料肉比和腹泻率。

3.2丁酸梭菌对断奶仔猪血清指标的影响 血清中总蛋白和白蛋白的含量增加是生物体蛋白质代谢旺盛的体现，说明机体内的蛋白质、氨基酸的吸收利用率是有所提高的，蛋白质在肝脏的合成代谢作用增强以及组织中的蛋白质沉积作用不断加强，机体内抵抗感染的重要蛋白就是球蛋白，其对免疫功能有很大影响，具有抗外毒素、抗病毒、抗细菌等作用。贾聪慧等（2016）发现添加丁酸梭菌组的肉鸡血清总蛋白含量有明显的升高 （p＜0.05)，免疫球蛋白有显著的提升。王柳懿等（2017）研究表明在仔猪日粮中添加丁酸梭菌，能激活TLR2/4信号通路，启动固有免疫应答，提高机体的免疫力。这些与本试验的结果相一致，丁酸梭菌组仔猪血清总蛋白明显升高，而球蛋白跟总蛋白的趋势一致，白球比明显降低。白蛋白变化不明显。说明添加丁酸梭菌组总蛋白升高，机体代谢旺盛。

在动物受到外界的应激或者损伤时细胞的通透性会增加，存在动物肝脏中的碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶就会进入血液，血液中这三种酶的活性明显增加。肝脏是否受损可以通过检测碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶的活性来判断（朱孟玲等，2010）。动物肝脏中的谷丙转氨酶是比较重要的转氨酶，对动物体内蛋白质的分解和非必需氨基酸的合成都起到了非常重要的作用（Song等，2004）。谷丙转氨酶和谷草转氨酶是与仔猪蛋白质的合成密切相关的，谷丙转氨酶和谷草转氨酶可促进蛋白质的合成（吴伟等，2012）。血清中的尿素氮能够反映动物体内的蛋白质的合成代谢状况以及日粮中氨基酸是否平衡。当日粮中的含氮物质增高，组织受到损害和动物体氨基酸代谢加强时尿素氮就会升高。动物体蛋白质合成加强，尿素氮就会降低。血清中的γ-谷氨酰基转移酶主要来源是肝细胞，肝脏受损γ-谷氨酰基转酶的活性明显升高（贾晓燕等，2006）。本试验中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰基转酶、肌酐和尿素，试验Ⅲ组与试验Ⅱ组相比增高以及试验Ⅰ组与对照组相比增高。说明攻毒大肠杆菌对仔猪肝脏产生了影响，谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶和肌酐在试验Ⅲ和试验Ⅰ组相比降低，说明丁酸梭菌对仔猪肝肾功能有一定的保护作用。

3.3丁酸梭菌对断奶仔猪抗应激能力的影响

动物受到应激时，衡量下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴（HPA轴）活性的方法是测定血清糖皮质激素的浓度（李吴阳等，2014)。皮质醇是肾上腺皮质分泌的 激 素 （Vebugghe 等 ，2012）。 Caroprese 等（2010）研究显示如果母羊受到了应激，HAP轴可以迅速的产生免疫应答和母羊的机体在应激条件下促进被动反应。杨培歌等（2013）表明血液中的肌酸激酶和乳酸脱氢酶可以反映机体能量代谢。动物受到热应激的时候，由于动物供应肌肉能量的不足，细胞受到了损伤，细胞膜的通透性增大，肌酸激酶从肌肉中溢出，导致血液中的肌酸激酶升高。在动物受到应激时，机体首先供应心脏和中枢神经系统的氧气，其他组织在无氧的条件下极有可能通过无氧酵解的方式进行供能，这样乳酸脱氢酶的含量就会升高。本试验表明肌酸激酶指标在试验Ⅱ与对照组相比降低，并且试验Ⅲ与试验Ⅰ相比降低，差异都显著（p＜0.05），说明丁酸梭菌在肌酸激酶的指标上起到了保护的作用；乳酸脱氢酶指标在试验Ⅲ与试验Ⅰ相比升高并且试验Ⅲ与试验Ⅱ相比升高，差异都极显著 （p＜0.01），说明试验Ⅲ组在受到大肠杆菌感染时乳酸脱氢酶迅速升高进而来缓解大肠杆菌带来的应激。皮质醇四组相比差异不显著但是攻毒大肠杆菌的试验组Ⅰ和试验组Ⅲ低于对照组和试验组Ⅱ，说明攻毒大肠杆菌对仔猪的HPA轴活性起到了抑制作用；在应激的条件下，动物机体神经兴奋，肾上腺髓质的分泌能力加强，致使肾上腺素升高，导致肝糖原分解，血糖升高，这是动物应激初期的表现（董淑丽等，2004）。血糖指标在试验组Ⅲ与试验组Ⅱ比较和试验组Ⅰ与对照组相比较中都有所提高，说明大肠杆菌对仔猪产生了应激。血糖在试验组Ⅱ与对照组相比下降，试验组Ⅲ与试验组Ⅰ和试验组Ⅱ相比升高，试验组Ⅲ与试验组Ⅱ相比试验组Ⅲ升高差异显著（p＜0.05）。说明丁酸梭菌对仔猪感染大肠杆菌起到了明显的适应反应。总体看来丁酸梭菌对仔猪感染大肠杆菌起到了保护作用。

4　结论

本试验结果表明，日粮中添加丁酸梭菌可以提高仔猪的生产性能，增加总蛋白的水平，改善肝肾的功能，有效缓解仔猪大肠杆菌病引起的应激。

[1]董淑丽，王占彬，雷雪芹，等.热应激对动物血液生化指标的影响[J].家畜生态，2004，25（2）：54 ～ 56.

[2]高印，王国军，来航线，等.益生菌发酵苹果渣对断奶仔猪生长性能、血清生化指标和粪便微生物菌群的影响[J].动物营养学报，2016，28（5）：1515 ～ 1524.

[3]黄俊.丁酸梭菌及其在养殖业中的应用[J].中国饲料添加剂，2012，12：38 ～ 40.

[4]贾聪慧，杨彩梅，曾新福，等.丁酸梭菌对肉鸡生长性能、抗氧化能力、免疫功能和血清生化指标的影响 [J].动物营养学报，2016，28（3）：908 ～ 915.

[5]贾晓燕，许梓荣，王丽.环境污染物砷对生长猪肝肾功能的影响[J].饲料工业，2006，27（9）：38 ～ 40.

[6]孔祥书，曾新福.丁酸梭菌制剂对生长猪生产性能的影响[J].中国饲料添加剂，2012，7：21 ～ 23.

[7]李海花，朱琪，王世琼，等.产肠毒素大肠杆菌K88诱导仔猪炎症反应的分子机制[J].中国畜牧兽医，2017，44（1）：262 ～ 267.

[8]刘秋玲，龚志华，陈凌，等.L-茶氨酸对产肠毒性大肠杆菌引起的免疫应激小鼠肝脏的保护作用研究[J].茶叶科学，2016，36（5）：469～476.

[9]李吴阳，钟荣珍，杨连玉.评价应激的方法及抗应激添加剂的研究进展[J].中国畜牧杂志，2014，50（13）：95 ～ 99.

[10]李玉鹏，李海花，王柳懿，等.丁酸梭菌对断奶仔猪生长性能、肠道屏障功能和血清细胞因子含量的影响 [J].动物营养学报，2017，29（8)：2961 ～ 2968.

[11]王柳懿，李海花，李玉鹏，等.丁酸梭菌对仔猪回肠免疫信号通路相关蛋白和血清细胞因子的影响[J].中国畜牧杂志，2017，53（8）：84 ～ 88.

[12]王腾浩.新型丁酸梭菌筛选及其对断奶仔猪生长性能和肠道功能影响的研究:[博士学位论文][D].浙江：浙江大学，2015.

[13]吴伟，王一凡，李晓翠，等.低聚果糖、芽孢杆菌制剂对断奶仔猪生长性能及免疫功能的影响[J].中国畜牧兽医，2012，39（6）：109 ～ 112.

[14]杨培歌，顾宪红.应激对猪生产性能、行为及血液理化指标的研究进展[J].中国畜牧兽医，2013，1：111 ～ 116.

[15]朱孟玲，陈超，马国辅，等.有机酸对长梅断奶仔猪生长性能和血清生化指标的影响[J]安徽农业科学，2010，38（33）：18861 ～ 18862.

[16]张秀江，胡虹，张永战，等.丁酸梭菌对仔猪和生长肥育猪生产性能的影响研究[J]河南科学，2015，33（10）：1745 ～ 1749.

[17]Caroprese M，Albenzio M，Marzano A，et al.Relationship between cortisol response to stress and behavior，immune profile，and production performance of dairy ewes[J].Journal of Dairy Science，2010，93（6）：2395 ～ 2403.

[18]Hayakawa T，Masuda T，Kurosawa D，et al.Dietary administration of probiotics to sows and/or their neonates improves the reproductive performance，incidenceofpost-weaning diarrheaand histopathological parameters in the intestine of weaned piglets[J].Animal Science Journal，2016，87（12）：1501 ～ 1510.

[19]Liao X D，Ma G，Cai J，et al.Effects of Clostridium butyricum on growth performance，antioxidation，and immune function of broilers[J].Poult Sci，2015，94（4）：662 ～ 667.

[20]Nakajima N，Matsuura Y.Purification and characterization of konjac glucomannan degrading enzyme from anaerobic human intestinal bacterium，Clostridium butyricum-Clostridium beijerinckii group[J].Biosci Biotechnol Biochem，1997，61（10）：1739 ～ 1742.

[21]Song K，Shan AS，LI J P.Effects of different combiantions of enzyme preparation supplemented to what based diets on growth and serum biochemical Values of broiler chickens[J].Acta Zoonutrimenta Sinica，2004，14（4）：25 ～ 29.

[22]Verbrugghe E，Boyen F，Gaastra W，et al.The complex interplay between stress and bacterial infections in animals[J].VetMicrobiol，2012，155：115 ～ 127.

[23]Xu X F，Xu P P，Ma C，et al.Gut microbiota，host health，and polysaccharides[J].Biotechnology Advances，2013，31（2）：318 ～ 337.