四株饲用芽孢杆菌的分离鉴定及其16S-rRNA的序列分析

柴 俊， 朱 丽， 宋泉芝， 刘旭川， 张以芳， 许 琳， 普岳红*

（1.云南农业大学省畜产品加工工程技术研究中心，云南昆明650201；2云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201）

芽孢杆菌（Bacillus），是一类能形成芽孢（内生孢子）的杆菌或球菌，为好氧或兼性厌氧的细菌，革兰氏染色呈阳性。当外界环境发生改变时，菌体内的结构发生变化，经过前孢子阶段，最终形成一个芽孢，对外界不良环境有很好的抵抗作用（刘秀花，2005）。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)等芽孢杆菌在生长过程中会产生多种活性物质，对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用，因其无毒、无害，被农业部允许作为饲料的添加剂，经常被制成微生物添加剂，用于改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病（Fouad 等，2017；龚福明等，2009；李佳，2009；李晶等，2008）。本试验对引进的样品进行芽孢杆菌的分离鉴定，为微生物饲料添加剂的研究和利用提供科学基础。

1　材料与方法

1.1试验材料 饲料样品及DH5α大肠杆菌为云南农业大学动物科学技术学院动物微生物实验室引进保存。

1.2试剂 高保真Taq聚合酶、pMD18-T载体、DH5α感受态细胞和各种内切酶均为TAKARA公司产品，细菌DNA基因组提取试剂盒、纯化回收试剂盒、质粒制备试剂盒均购自Bioteke公司。1.3 分离培养及染色镜检观察 样品经80℃高温处理10～15 min。用无菌生理盐水稀释后倾注入芽孢富集培养基中，37℃培养24 h，然后在LB固体培养基上划线分离培养，37℃培养24 h后，挑取不同形态特征的单个菌落，进行纯培养及涂片染色镜检观察。

1.4生化鉴定 按 《伯杰细菌鉴定手册》（第8版、第9版）中的方法对纯培养细菌进行生理生化鉴定（Holt等，1994；布坎南等，1986）。

1.516S-rRNA扩增及测序 根据GenBank中芽孢杆菌的16S-rRNA的相关序列设计本研究的引物： 上游引物 PR：8-27 （5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’），下游引物 PF：1525-1541（5’-AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’)，目的片段大小为1500bp左右。

细菌全DNA基因组的提取：取分离菌株的单个菌落在LB液体培养基中培养至细菌对数生长期，用BIOTEKE公司细菌DNA提取试剂盒按说明书步骤，提取细菌总DNA，提取的DNA产物经1%琼脂糖凝胶电泳，检测结果，并初步估计其DNA含量。

PCR体系与反应条件：反应体系为50 μL：DNA 模板 4 μL， 10×PCR Buffer 5.0 μL，Ex Taq（5 U/μL)0.5 μL，dNTP mixture 4.0 μL， 上下游引物（20 μM）各 1 μL，ddH2O 34.5 μL。 PCR 反应程序：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃1 min，72 ℃1.5 min，共30个循环；72℃10 min；4℃ 保存。PCR结束后，取5 μL PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，检测结果。

PCR扩增产物回收纯化及克隆测序：参照BIOTEKE公司DNA纯化试剂盒说明对PCR扩增的16S-rRNA产物进行纯化回收。纯化产物与pMD18-T载体连接构建重组质粒，将得到的重组质粒转入到DH5α感受态细胞中，经氨苄抗性筛选、蓝白斑筛选获得阳性克隆，提取质粒。对重组质粒进行酶切和PCR鉴定，并将鉴定结果正确的重组质粒送TAKARA公司测序。

1.616S-rRNA同源性及系统发育树分析 从GenBank中下载有关饲用微生物菌株及芽孢杆菌菌株的16S-rRNA代表序列作为参比序列。下载的序列信息见表1。利用DNAStar软件对测得的序列及参比序列进行同源性比较。并利用ClusterX和Mega5.0构建系统发育树，进行系统进化亲缘关系研究（Baindara等，2013；Leite等，2013）。

2　结果与分析

从样品中分离到4株芽孢杆菌，分别命名为YB-1、YB-2、YB-3、YB-4， 经表型特性及 16S-rRNA序列分析，YB-1为苏云金芽孢杆菌、YB-2、4为枯草芽孢杆菌、YB-3为蜡样芽胞杆菌。其特性结合描述如下：

表1　饲用微生物中芽孢杆菌代表菌株的参比序列

2.1菌落特征 细菌在普通琼脂平板上，YB-1为白色圆形菌落，边缘整齐，表面透亮，湿润，光滑，中央隆起，黏稠，直径2～5 mm；YB-2为白色滴状菌落，边缘不整齐，中央微隆起，表面无光泽，干燥，直径0.5～1 mm；YB-3为白色滴状菌落，边缘整齐，中央隆起，表面光滑湿润，清亮，黏稠，直径1.5～2mm；YB-4为白色圆形菌落，边缘不整齐，表面无光泽，干燥如毛玻璃样，直径0.5 mm。

2.2形态特性 挑取单个菌落涂片染色后光镜下观察，菌落为杆状呈簇状或散在存在的革兰氏阳性细菌。在不利环境下，形成芽孢。

2.3生化鉴定结果 细菌的生化鉴定结果为：（1）4株分离菌的接触酶、运动性、葡萄糖发酵、硝酸盐还原、淀粉水解酶反应都呈应阳性；尿素水解酶、M.R试验、吲哚试验、卵磷脂试验都呈阴性；（2）YB-2和YB-4分离菌的木糖、阿拉伯糖、甘露醇、V.P试验、明胶液化试验都是阳性；YB-1分离菌的木糖、阿拉伯糖、甘露醇、V.P试验、明胶液化试验都是阴性；YB-3分离菌的木糖、阿拉伯糖、甘露醇的试验为阴性，V.P试验、明胶液化试验是阳性。生化试验结果见表2。

2.3细菌16S-rRNA PCR扩增 4株菌株提取DNA，利用16S-rRNA引物PCR扩增，得到约1.5kb大小的目的片段，结果见图1。

2.4重组质粒的PCR鉴定结果 将获得的目的片段与pMD-18T载体连接，构建的重组质粒转入DH5α感受态细胞中培养提取质粒，进行PCR鉴定，结果见图2。

2.5重组质粒双酶切鉴定结果 重组质粒用Bam HI、HindⅢ 进行双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳，可见酶切后产生两条带，大小与预期相符，结果见图3。

表2　生化试验结果

图1　四株芽孢杆菌的16S-rRNA基因扩增电泳图

图2　重组质粒及质粒PCR扩增电泳图

图3　重组质粒双酶切电泳图

2.616S-rRNA序列同源性及系统发育树分析结果 根据 YB-1、YB-2、YB-3、YB-4 的 16S-rRNA的测序结果，进行BLAST序列比对分析和系统进化树分析。采用MEGA5软件，分析4株分离菌与饲用微生物中芽孢杆菌的参比序列，绘制系统进化树（见图4）。4株分离菌与系统进化树远端的侧孢芽孢杆菌的的同源性分别为88.35%、88.83%、89.68%和87.87%，表明分离菌与其遗传距离较远。YB-2、YB-4与枯草芽孢杆菌类群的B.subtilis HE937219的同源性分别为99.91%和100%，均在99%以上，且处于同一分支上，表明YB-2、YB-4属于枯草芽孢杆菌。YB-1与苏云金芽孢杆菌类群的B.thuringiensis AM292315的同源性为99.17%，在99%以上，处于同一分支，表明YB-1属于苏云金芽孢杆菌。YB-3与蜡样芽孢杆菌类群的B.cereus NC_016771同源性为100%，表明YB-3属于蜡样芽孢杆菌。

图4　4个分离株16S-rRNA与5个参比序列构建的进化树

3　讨论

细菌芽孢对外界环境不利于菌体生长的环境，如高温、过酸等环境有较强的抵抗力。本试验在样品处理初期就经过80℃的高温处理，除去了共生繁殖体的细菌，只有芽孢菌存活下来，使得试验在初期分离细菌的过程中简化了试验时间和步骤。

目前国内外常用的饲用微生物种类主要有乳酸菌、芽孢杆菌、酵母菌、放线菌、光合细菌等几大类（Fouad 等，2017；龚福明等，2009；李佳，2009；李晶等，2008）；其中芽孢杆菌主要有侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌等。本研究从引进的饲料样品中分离到的芽孢杆菌种类有枯草芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌和苏云金芽孢杆菌，都是常用于饲料中的芽孢杆菌，可为本地微生物饲料添加剂的进一步发展提供研究基础。

[1]布坎南RE，吉本斯RE.伯杰细菌鉴定手册（第8版）[M].北京：科学出版社，1986.

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