抗真菌药物棘白菌素应用过程中“矛盾现象”的特点、发生机制研究进展

宋星澎，郑锐

(中国医科大学附属盛京医院，沈阳 110022)

侵袭性真菌感染是重症患者死亡的首要原因。目前抗真菌药物较少，多烯类(如两性霉素B)、咪唑类(如氟康唑，泊沙康唑和伏立康唑)，嘧啶类似物(如氟胞嘧啶)和棘白菌素(如卡泊芬净，米卡芬净和阿尼芬净)等四类是侵袭性真菌感染的主要治疗药物。多烯类和咪唑类可直接或间接影响真菌膜，氟胞嘧啶则通过干扰DNA和RNA合成发挥抗菌作用。新一代抗真菌药物棘白菌素是一种葡萄糖聚合酶抑制剂，通过非竞争抑制1-3-β-D葡聚糖合成酶，造成细胞壁葡聚糖含量减低，破坏细胞壁结构，最终导致菌体破裂死亡。棘白菌素对念珠菌显示优异的抗真菌活性，并且对多数曲霉属物种具有良好的抑菌作用[1，2]。棘白霉素耐药率较低，是目前侵入性念珠菌病经验性治疗的首选药物，是侵袭性曲霉病的二线治疗药物[3,4]。标准化条件下进行药物敏感性测试时，棘白菌素可发生“矛盾现象”。棘白霉素类抗真菌药物的“矛盾现象”是指在棘白霉素药物低浓度时真菌表现敏感，但随药物浓度升高，真菌对其敏感性反而下降，甚至产生耐药的现象，浓度非常高时，真菌再次对棘白霉素敏感[5～8]。念珠菌属和曲霉菌属均可在体外对棘白霉素类抗真菌药物产生“矛盾现象”。目前，“矛盾现象”的产生机制及影响因素等方面尚有诸多不明确，“矛盾现象”是否对临床治疗真菌存在影响尚存在争议。本文对棘白菌素应用过程中“矛盾现象”的特点及发生机制相关研究进展综述如下。

1 “矛盾现象”的特点

“矛盾现象”于1988年在体外研究中被发现[9],在较低剂量(<1 μg/mL)时棘白霉素可有效抑制真菌细胞壁合成，有效杀死念珠菌，抑制曲霉菌伸张；加入较高剂量(4～32 μg/mL)棘白霉素时菌落出现生长；加入浓度非常高(约> 64 μg/mL)的棘白霉素时真菌再次对棘白霉素变得敏感，出现抑制生长，这种特异的现象被称为“矛盾现象”[5～8]。并非每一种棘白菌素类抗真菌药物均可导致“矛盾现象”。卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净等三种棘白菌素衍生物最常导致念珠菌“矛盾现象”的是卡泊芬净。药物导致“矛盾现象”的概率随念珠菌菌属不同而不同。体外试验[10]表明，卡泊芬净及阿尼芬净导致真菌发生“矛盾现象”的可能性明显高于米卡芬净，卡泊芬净的“矛盾现象”常见于热带念珠菌及近平滑念珠菌，阿尼芬净的“矛盾现象”常见于白色念珠菌及光滑念珠菌。热带念珠菌更容易发生矛盾生长。烟曲霉菌株中卡泊芬净的“矛盾现象”在治疗中更常见[11]。然而，不同研究报道的单个棘白菌素抗真菌药物和不同真菌分离株之间“矛盾现象”的发生率差异很大。Chamilos等[12]观察到20个临床分离株中有12个(60%)存在卡泊芬净导致白色念珠菌矛盾生长。Fleischhacker等[13]在101个临床分离株中仅发现14个(14%)可发生“矛盾现象”的真菌，尽管使用同种菌属及同类棘白菌素，二者结果仍差异较大，可能与不同研究之间的方法学差异有关。

培养基成分、培养基添加剂及确切培养条件不同，棘白菌素应用过程中发生“矛盾现象”的概率不同。Stevens等[14]研究发现，与RPMI 1640培养基(无血清细胞冻存基础培养基)相比，合成氨基酸培养基真菌(SAAMF)中白色念珠菌的矛盾生长更明显，平均来说，PRMI培养基需要两倍于SAAMF培养基的棘白菌素浓度才能诱发“矛盾现象”，而两种培养基在试验过程中均保持同样的生理pH浓度，表明这一差异与pH值无关，而在酵母氮基培养基(YNB)中不太明显，高浓度血清(50%)补充RPMI 1640可以消除卡泊芬净的“矛盾现象”。较低血清浓度(10%)则会大幅增加诱导“矛盾现象”所需的棘白霉素浓度[15]，高血清浓度(50%)对曲霉菌的矛盾生长有抑制作用[16]，这一现象与血清对棘白菌素的作用靶点的干涉，对蛋白结合率的下调，以及对药物弄得的稀释等多方面因素有关，而在人体内生理环境更加复杂，增加了“矛盾现象”出现的难度.总之，培养基的具体基础类型，添加的血清浓度等因素均会影响“矛盾现象”的产生。

棘白菌素的浓度是否稳定也可影响“矛盾现象”发生的几率。 Stevens等[7]已经观察到当在固体培养基(琼脂)圆盘扩散方法检测抗菌药物敏感性由于药物浓度的不稳定，“矛盾现象”似乎遭到抑制。 而对卡泊芬净的间歇暴露不仅抑制了矛盾的生长，而且还增加了卡泊芬净的抗菌活性，提升了卡泊芬净的抗感染效果。生物膜法培养与传统的微生物培养方法相比更容易出现“矛盾现象”[17]。Melo等[18]研究证实，使用生物膜时，更加频繁地观察到“矛盾现象”的出现。而棘白菌素是否能维持稳定的浓度是另一个影响“矛盾现象”的因素，Stevens等[7]研究发现，当在固体培养基(琼脂)不稳定的药物浓度对“矛盾现象”产生了抑制作用，Shields等[15]研究发现，间歇性暴漏于棘白菌素作用下，可有效地抑制“矛盾现象”，且进一步增加卡泊芬净的杀菌效果[19]。但是这种现象只在卡泊芬净高浓度范围内(4～32 μg/mL)，可能原因为卡泊芬净可抑制1-3β葡聚糖的合成及诱导凋亡[20]。

2 “矛盾现象”的发生机制

“矛盾现象”是单纯的体外现象还是与临床治疗真菌感染有关，目前临床尚无定论。没有临床试验证明“矛盾现象”会影响人类的抗念珠菌治疗。动物试验表明，“矛盾现象”有可能影响棘白菌素的杀菌效果，但并不会影响念珠菌感染的预后[21]。曲霉菌感染的动物试验提示，“矛盾现象”有可能增加棘白菌素的治疗剂量，然而动物模型中的“矛盾现象”并未影响实验动物的存活率[22]。目前还未明确在临床中发现“矛盾现象”。因为体内“矛盾现象”可能受血清、药物浓度波动等多种因素影响。血清内药物浓度的不稳定可能阻碍了“矛盾现象”的出现，而导管和植入物感染引起的微生物生物膜效应可能增加“矛盾现象”的出现率，而在高剂量棘白菌素下仍持续感染，或引入具有特别长效作用的新的棘白菌素衍生物，如棘白菌素CD101，均可能在人体内诱发“矛盾现象”[23，24]，但是人体内“矛盾现象”仍有待进一步的研究观察。

inp51及irs4基因与“矛盾现象”可能有关，抑制这两处基因表达可消除“矛盾现象”的出现。考虑这两处基因可能与1-3β葡聚糖合成有关，但是具体途径仍还有待明确，而与常见的耐药相关基因的突变FKS1关系复杂，有研究提示矛盾效应与FKS基因表达无明显关系[25]，而既往研究表明几丁质的合成与FKS1基因无关，但是现在有研究表明，在“矛盾现象”中，菌丝中1-3-β葡聚糖会从棘白菌素抑制下逐渐恢复，表明这一过程中1,3-葡聚糖合成得到恢复，提示1,3-葡聚糖合酶Fks1的表达很可能与“矛盾现象”有关，而fks1的过表达则使得曲霉菌更易感，而减少表达导致菌丝更能耐受棘白菌素的杀菌作用[26]。

目前针对“矛盾现象”的机制，首先考虑与细胞壁的几丁质的合成有关。使用尼可霉素抑制几丁质的合成可有效消除“矛盾现象”，而在体外实验中卡泊芬净的刺激下，可发现曲霉菌的几丁质合成会明显升高，几丁质使用N-乙酰葡萄糖氨分子以β-1.4葡萄糖苷键聚合而成，处于真菌细胞壁的最内侧，临近质膜，呈放射状，是真菌菌丝尖端生长最主要成分。在卡泊芬净“矛盾现象”发生时，可观察到明显的丝裂原活化蛋白激酶MpkAMPK1及其相关转录因子(TF)RlmARLM1上调，依赖于钙和钙依赖磷酸酶的转入因子 CrzA与MRNA结合并调节特定几丁质合酶基因的表达，增加细胞壁几丁质的合成[27]，大幅增加几丁质的合成，有三个信号通路被确定为上调棘白菌素处理对几丁质合成的响应。Walker等[28]发现在白色念珠菌中，PKC途径、高渗透甘油(HOG)和神经钙蛋白三个途径相互刺激几丁质合成酶Chs2和Chs8促进及定制的合成，以抵抗棘白菌素的作用。磷酸酶A催化亚基CnaA和下游钙调磷酸酶响应性锌指转录因子CrzA的缺失的烟曲霉突变体则会出现对棘白菌素的敏感性增加，导致“矛盾现象”消失[29]。真菌细胞溶质游离Ca2+瞬时增加，激活钙调蛋白-钙调磷酸酶信号，钙调蛋白和钙调磷酸酶基因表达增强，促进菌丝生长[30]，在受到钙离子拮抗剂的作用，“矛盾现象”也会出现明显减退，此外，“矛盾现象”与β葡萄糖聚合酶有关，当矛盾生长出现时，菌丝顶端β葡萄糖聚合酶将出现局部更新，促进β-1,3-葡聚糖合成，以保护菌体[31],这种机制的表现似乎与棘白菌素衍生物有关，仅在某些菌株和物种中发生，并且需要数天才能显现。目前考虑在棘白菌素作用下真菌首先出现几丁质合成增加，以抵抗棘白菌素作用，在后续过程中出现β葡聚糖酶局部高表达，促进1，3-β葡聚糖的合成，但是，真菌重建β-1,3-葡聚糖合成的机制仍未明确[32]。但是“矛盾现象”的产生，几丁质之间及1，3β葡聚糖之间的关系复杂，有研究表明，在“矛盾现象”中，可发现由于1，3β葡聚糖增加引起几丁质合成减低，并通过增加自身合成来增强细菌的活性，而几丁质的合成则只能更加与FKS1基因活性减低有关，FKS基因活化则会抑制几丁质合成[5]， 考虑“矛盾现象”中细胞壁的合成是一个动态复杂的过程。目前磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸-5磷酸以及热休克蛋白缺乏也被认为与“矛盾现象”有关，磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸-5磷酸被破坏，引起PKC-Mkc1过度激活途径的激活，增加对棘白菌素的敏感度，消除“矛盾现象”。也有研究[33，34]提示热休克蛋白90(Hsp90)参与烟曲霉菌磷酸酶对棘白菌素的应激反应，激活钙调磷酸酶，促进细胞壁的合成，在热休克蛋白受抑制的情况下，会增加念珠菌的敏感性，会提高可消除“矛盾现象”。

综上所述，不同棘白菌素类抗真菌药物导致真菌发生“矛盾现象”的几率不同，卡泊芬净是最常引起念珠菌发生“矛盾现象”的抗真菌药物。念珠菌属和曲霉菌属均可在体外对棘白霉素类抗真菌药物产生“矛盾现象”。

药物导致“矛盾现象”的概率随念珠菌菌属不同而不同。“矛盾现象”的发生可能与inp51及irs4基因过表达、细胞壁几丁质合成、葡萄糖聚合酶有关磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸-5磷酸以及热休克蛋白等因素有关。是否有其他基因参与“矛盾现象”的发生，热休克蛋白等因素影响“矛盾现象”的具体途径，仍有待进一步的研究。