结直肠癌组织中癌胚抗原相关细胞黏附分子-1的表达变化及其意义

段佳文，林杨 ，郭飞，屈明，薛军

(1河北北方学院附属第一医院,河北张家口0750002；2河北北方学院研究生院)

结直肠癌是一种严重危害人群健康的恶性肿瘤。近年，结直肠癌的发病率逐年升高，且呈年轻化趋势。结直肠癌的治疗仍以手术为主，强调早发现、早治疗。特异性、准确性较高的生物学指标对结直肠癌的早发现、早诊断、早治疗及预后监测具有极其重要的价值[1,2]。癌胚抗原相关细胞黏附分子-1(CEACAM-1)作为癌胚抗原家族重要成员之一，能调控细胞增殖、凋亡和分化，同时介导肿瘤细胞的黏附，还参与血管和淋巴管新生等病理过程[3,4]。CEACAM-1在乳腺癌、子宫癌、胃癌、胰腺癌等恶性肿瘤中均呈高表达[5,6]，而在结直肠癌中的表达相关报道较少。本研究观察了50例份结直肠癌组织CEACAM-1 mRNA及蛋白的表达变化，探讨其临床意义。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2013年1月～2014年1月间我院收治的50例原发性直肠癌患者，其中其中男27例、女23例,年龄35～71(52.3±9.0)岁；TNM分期为Ⅰ期2例、Ⅱ期9例、Ⅲ期27例、Ⅳ期12例。入选标准：经病理检查确诊，均为原发性肝癌，未进行术前新辅助放化疗，且病例资料完整无误。排除标准：术前行新辅助放化疗治疗，复发性肝癌，有心脑血管疾病及其他手术禁忌证等。50例患者均行肿瘤切除术，术中保留癌组织(观察组)及癌旁组织(对照组，至癌灶边缘至少10 cm处且经病理诊断确诊为正常组织)标本。本实验经本院伦理委员会批准，纳入者均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂 兔抗人浓缩型CEACAM-1单克隆抗体、免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒购于北京中杉公司，RM-2245组织切片机购于德国LEICA公司，Odyssey双色红外荧光成像仪购于德国LI-COR公司，TRIzol试剂购于美国Invitrogen公司，DEPC水购于美国Sima公司，RIPA裂解液、蛋白酶抑制剂购于上海基星生物科技有限公司。

1.3 CEACAM-1 mRNA检测方法 采用RT-PCR法。提取总RNA浓度，设计CEACAM-1上游引物：5′-CAGTCACCTTGAATGTCACCTATG-3′，下游引物：5′-GTTCCATTGATAAGCCAGGAGTAC-3′；GAPDH上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3′；反应体系：1×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP 0.5 μL，cDNA模板2 μL，Taq酶1.25 U，上下游引物各1 μL，RNA 酶抑制剂1 μL，反应总体积25 μL。扩增条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，40个循环，2%琼脂糖凝胶后电泳。以2-△△Ct代表CEACAM-1 mRNA的相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.4 CEACAM-1蛋白检测方法 采用免疫组化SP法检测CEACAM-1蛋白。取两组标本，石蜡包埋后4 μm切片，脱蜡水化，冲洗后灭活内源性过氧化物酶，枸橼酸缓冲液高温高压水化修复，冰水中冷却，PBS冲洗，3%的H2O2室温封闭，PBS冲洗，滴加CEACAM-1一抗(1∶200)。每张切片50 μL，4 ℃过夜。PBS冲洗，滴加特异性二抗，室温下DAB显色，PBS冲洗，苏木精轻度复染，盐酸乙醇分化，流水冲洗，梯度乙醇脱水，松节油透明，树胶封片，阴性对照为PBS代替一抗，光镜下观察。CEACAM-1阳性染色主要集中于细胞质中，细胞质中出现明显棕色或棕黄色颗粒且染色程度大于25%的细胞为CEACAM-1阳性细胞，计算两组阳性表达率。阳性表达率=阳性细胞数/总细胞数×100%。实验重复3次，取平均值。

1.5 随访方法 术后随防至2017年12月31日，随访方法为定期复查、电话随访。

2 结果

观察组、对照组CEACAM-1 mRNA相对表达量分别为0.99±0.08、0.20±0.05，二者比较，P<0.05；观察组、对照组CEACAM-1蛋白阳性表达率分别为68.00%(34/50)、28.00%(14/50)，二者比较，P<0.05。CEACAM-1表达与结直肠癌临床病理参数的关系见表1。CEACAM-1表达与结直肠癌的TNM分期、淋巴结转移及肝转移等有关(P均<0.05)。

中位随访时间56个月，50例患者中23例生存，27例死亡。 死亡、生存患者CEACAM-1的阳性表达率分别为88.89%(24/27)、43.48%(10/23)，二者比较，P<0.05。Kaplan-Meier生存曲线结果显示，CEACAM-1表达阳性和阴性患者的生存函数比较差异有统计学意义(χ2=4.394，P=0.031)，即CEACAM-1表达和患者生存时间相关，CEACAM-1阳性患者预后较差。

表1 结直肠癌组织中CEACAM-1蛋白的表达与肿瘤临床病理参数的关系(例)

Cox回归模型分析显示，CEACAM-1表达、肝转移、淋巴结转移和TNM分期均是影响结直肠癌患者预后的独立因素(95%CI分别为1.365～1.917，1.725～2.363，1.041～1.620，1.160～1.741；P均<0.05)。

3 讨论

CEACAM-1是一种跨膜糖蛋白，属于癌胚抗原家族及免疫超蛋白家族黏附分子之一，最初是由Ocklind等[7]在研究木瓜蛋白酶质膜的不溶性成分的某些作用和功能时被发现，在人体内皮细胞、上皮细胞、淋巴细胞等多种细胞中都有较为广泛的分布。CEACAM-1基因定位于人类染色体的19q13.2区域，该基因的组成是由9个外显子按特定序列排列而成，第1个含ATG启动子，第2个负责编码IgV样结构域，第3至5个外显子则用于编码IgC2样结构域，第6个编码TM跨膜区，第7个包含53个bp，可通过选择性剪接产生CEACAM-1-L、CEACAM-1-S长短两种不同的亚型，较长的CEACAM-1-L包含第 7、8个外显子，由72～74个氨基酸残基构成，而较短的CEACAM-1-S则由12～14个氨基酸残基构成，仅含第9个外显子TGA-S[8]。CEACAM-1-L胞内段含有2个免疫受体酪氨酸抑制基序通过其磷酸化参与细胞内信号转导，发挥抑制下游信号的作用，而CEACAM-l-S则无此基序，但含有结合钙调蛋白、原肌球蛋白和肌动蛋白的结构域，对细胞骨架有调节作用。在细胞表面CEACAM-1-L主要以一种顺式同源二聚体的形式存在，不同活化状态下的细胞二聚体不同，可能参与不同的信号调节通路，CEACAM-1-L还可以在细胞间形成反式二聚体，介导细胞间黏附[9]。

CEACAM-l还可参与调节细胞增殖、凋亡及细胞分化，对胰岛素代谢和免疫调节等生理过程具有重要作用。研究[10]证实，CEACAM-1参与了肿瘤发生、发展、浸润与转移等一系列生物学过程，其异常表达可能是引起和维持结直肠癌恶性表型的原因之一。此外，CEACAM-1还与脉管结构形成有不可分割的关系，这其中就包括对肿瘤生长、浸润和转移发挥重要作用的血管、淋巴管生成过程[11,12]。CEACAM-1与血管内皮生长因子VEGF的关系极为密切，是VEGF的一个重要效应分子。一项研究发现，CEACAM-1的高表达会引起VEGF、VEGFR-2、angiopoietin-1等血管生长因子表达上调，促进微血管内皮细胞分裂，进而形成微血管，而当使用抗体抑制CEACAM-1后，相应的VEGF介导的微血管转化也收到抑制[13]。Yurdakul等[14]研究显示，CEACAM-1在肿瘤组织的淋巴管内皮中常有表达，可能是肿瘤新生淋巴管的标志物。Horst等[15]的小鼠模型实验论证了在调节微淋巴管重建的过程中，内皮细胞上的CEACAM-1表达起到了重要作用，相反基质胶阻塞试验及后肢缺血模型的新生毛淋巴管重建的失败正是由CEACAM1的缺少造成。

本研究结果发现，观察组CEACAM-1 mRNA及蛋白表达均高于癌旁组织，表明CEACAM-1高表达可能促进结直肠癌变的发生和发展，且CEACAM-1表达越高，其对周围组织器官的侵袭能力越强，肝转移、淋巴结和血行转移风险越大，TNM分期越晚。吴涛等[16]研究证实结直肠癌组织中CEACAM-1参与肿瘤微血管的生成及血管浸润转移。申宝鸣等[17]报道大肠癌患者的血清中CEACAM-1水平明显超过正常组，CEACAM-1很可能是大肠癌早期诊断的一项重要指标。进一步研究显示CEACAM-1与结直肠癌患者的生存期相关，CEACAM-1表达越高，其生存期越短，预后越差，CEACAM-1表达是结直肠癌患者预后的重要危险因素。

综上所述， 结直肠癌组织中存在CEACAM-1高表达。CEACAM-1的表达异常在结直肠癌病变的发生、发展中发挥重要作用，CEACAM-1可能与结直肠癌的预后有关。