肝细胞肝癌组织中Per2、CD133蛋白的表达观察

刘利平，张悦，刘林森，郭跃华，张育森，鲍世韵

(暨南大学第二临床医学院深圳市人民医院,广东深圳 518000)

环境因素是肿瘤的发病原因之一。生物钟是人体内的生物节律，与自然界的日出、日落相同步，受多个生物钟基因调控[1]。研究[2,3]发现，生物钟紊乱的人群(如倒夜班)更易患乳腺癌、前列腺癌、胆管癌等恶性肿瘤。Per2基因是生物钟基因家族中重要的成员之一[4]。研究[5]发现Per基因除了参与生物钟调控外，还可抑制肿瘤细胞的生长和增殖，诱导细胞凋亡，在胰腺癌、胃癌、结直肠等多种肿瘤组织中呈低表达状态，被认为是潜在的抑癌基因。目前Per2在肝癌中的表达及意义国内尚未见文献报道。CD133是肝癌干细胞的标记物之一，在肝癌组织中高表达，与肝癌患者的预后呈负相关，CD133高表达的患者较易复发和转移，预后较差[6]。Per2同CD133在肝癌组织中的相关性目前未见报道。本研究观察了肝细胞肝癌组织Per2 的表达变化，并分析其与CD133的相关性。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2011～2015年在深圳市人民医院肝胆外科行肝癌根治性手术且经病理证实的120例肝细胞肝癌患者，其中男97例、女23例，年龄32.6～70.2，平均53.4岁；乙肝表面抗原呈为阳性，HCV抗体阴性。所有患者术前均未接受过化疗、放疗、靶向治疗及免疫治疗。纳入标准：病理诊断为原发性肝细胞癌；未见远处转移；接受了肝癌根治术；手术切缘阴性，未见肿瘤细胞。排除标准：接受过放疗、化疗、免疫治疗、靶向治疗或中药治疗；乙肝表面抗原阴性；HCV抗体阳性；同时合并其他类型的恶性肿瘤；随访信息不全。术中保留120例患者癌组织、癌旁组织(距肿瘤距离均>2 cm)标本。

1.2 肝细胞肝癌癌组织及癌旁正常组织Per2、CD133检测 采用免疫组化染色法检测癌组织及癌旁正常组织Per2、CD133，所有操作均严格按照使用说明书进行。采用PBS代替一抗作为阴性对照。Per2、CD133蛋白在肝癌组织中均以细胞质表达为主，Per2根据细胞质的染色程度及染色细胞的百分率来进行评分[6]。Per2阳性细胞百分比<5%计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分；细胞染色无色计0分，黄色计1分，棕黄色计2分，棕褐色计3分。两者相乘即为最终分数(代表蛋白相对表达量)，0～4分视为低表达，5～12分视为高表达。CD133根据阳性细胞比例和染色深浅评为 0～3分，0分：阳性细胞不超过1%；1分：阳性细胞超过1%，细胞呈黄色；2分：阳性细胞超过1%，细胞呈棕黄色；3分：阳性细胞超过1%，细胞呈棕褐色。其中0和1分定义为低表达，2和3分定义为高表达[7]。

2 结果

肝细胞肝癌癌组织及癌旁正常组织Per2蛋白相对表达量分别为5.05±0.30、7.18±0.31，二者比较，P<0.05。癌组织中Per2蛋白低表达58例(48.3%)、高表达62例(51.7%)。肝细胞肝癌癌组织及癌旁正常组织CD133蛋白相对表达量分别为1.68±0.11、0.82±0.09，二者比较，P<0.05。癌组织中CD133蛋白低表达67例(55.8%)、高表达53例(44.2%)。

Per2蛋白表达与肝细胞肝癌患者临床病理参数的关系见表1。Per2蛋白表达与肝细胞肝癌患者肿瘤直径、肿瘤数目、门静脉侵犯有关(P均<0.05)。

表1 Per2蛋白表达与肝细胞肝癌患者

Kaplan-Meier时间生存曲线分析结果显示，癌组织中高表达Per2者、癌组织低表达Per2者总体生存率(OS)分别为(34.4±2.5)、(26.9±2.3)个月，二者比较，P<0.05；癌组织中高表达Per2者、癌组织低表达Per2者无瘤生存率(DFS)分别为(16.3±1.7)、(9.72±1.41)个月，二者比较，P<0.05。

相关性分析结果显示，Per2与CD133在原发性肝癌中的表达呈负相关(r=-0.569,P<0.05)。

3 讨论

生物钟是人类在进化过程中与自然界同步而形成的内在生物节律，在体温、呼吸、血压、进食、睡眠、血糖、内分泌等诸多稳态中发挥着重要作用[8]。生物钟对人体精准调控的分子机制在于生物钟基因及其编码蛋白构成了自主调节转录-翻译反馈通路[9]。目前已经发现的生物钟基因有CLOCK、BMAL1、Per1、Per2、Per3、Cryptochrome 1 (Cry1)、Cryptochrome 2 (Cry2)、NPAS2、Casein Kinase 1 ε(CKIε)、timeless(Tim)、Rev-Erb和DEC等[10]，以上基因通过转录和转录后调控形成的自反馈环来调节细胞内的生物节律。生物钟基因表达紊乱可导致生物节律异常，可能与肿瘤的发生、发展有关[11]。

period(PER)基因首先在果蝇的X染色体中发现，果蝇PER基因存在三种突变型，分别为perO、perL和perS，三种突变型的表型分别为昼夜节律消失、昼夜节律延长及昼夜节律缩短。随后，小鼠和人的Per基因被发现，且存在Per1、Per2、Per3 这3种基因型[4]。后续研究[12]发现Per基因除参与生物钟调控外，还能抑制肿瘤细胞的生长和增殖，诱导细胞凋亡。Per2基因在结直肠癌、胃癌、非小细胞肺癌、等多种肿瘤中呈低表达[4,8,9]。Su等[13]研究发现，沉默口腔鳞癌 SCC15细胞 中PER2的表达后，增殖相关基因Ki-67、 转移相关基因MDM2、MMP2、癌基因c-Myc、抗凋亡蛋白Bcl-2、血管生成相关基因VEGF的表达均上调，抑癌相关基因 p53、凋亡相关基因 Bax、转移抑制基因TIMP-2 的表达均下调；且Per2沉默后的SCC15细胞成瘤能力明显增强。Per2沉默的肺腺癌细胞A549中(PI3K)/AKT/mTOR信号通路被激活，细胞对顺铂表现出一定的耐药性。在A549/DDP耐药细胞中上调Per2的表达可抑制(PI3K)/AKT/mTOR通路的活性和逆转顺铂的耐药性[14]。

本研究结果发现，肝癌组织中的Per2 mRNA及蛋白的相对表达量均低于低于癌旁组织，表明Per2低表达可能与肝癌的发生有关。进一步分析发现Per2在多发、肿瘤直径>5 cm及伴血管侵犯的肝癌中阳性表达率更低，提示Per2低表达可能是肝癌预后不良的因素之一。生存分析显示Per2低表达的肝癌患者无瘤生存率和总体生存率均明显降低。提示Per2可以作为判断肝癌患者术后预后的预测因子。肝癌是一个较易复发和转移，恶性程度非常高的肿瘤。肝癌术后检测肿瘤组织中Per2的表达，对低表达的患者加强随访和监测，有可能较早的发现复发和转移的病灶，较早地给予处理可以改善患者的预后。

肿瘤干细胞是肿瘤发生、发展的根源。肿瘤干细胞与普通肿瘤细胞的鉴别依赖于其表面的干细胞标记物[15]。CD133是肝癌的干细胞标记物之一，是一种5次跨膜糖蛋白，在1997年分别从人造血干细胞和CD34+的小鼠神经干细胞中分离得到，并分别命名为AC133和prominin-1[16]。进一步研究发现，人类的AC133和小鼠的prominin-1在细胞和亚细胞结构上的分布相似，基因具有高度相似性。人的prominin-1基因又称为CD133[17]。CD133在正常肝组织中阴性表达，在部分慢性肝炎、肝硬化组织中阳性表达，可能与肝脏再生有关，这部分表达CD133的肝细胞可能是一种具有自我更新和定向分化能力的原始肝细胞[15]。CD133在肝癌组织中的表达明显高于其在癌旁、肝炎和肝硬化组织，显示CD133阳性的肝癌细胞具有更高的细胞增殖能力和更强的侵袭转移能力。Chan等[19]研究发现，小肝癌和合并肝硬化的肝癌组织中CD133蛋白表达升高，CD133阳性的肝癌患者预后较差，CD133可作为判断肝癌术后复发和转移的有效标记物。

综上所述，肝细胞肝癌组织中Per2低表达、CD133高表达。Per2可作为判断肝癌患者预后的标记物之一。Per2和CD133在肝细胞肝癌中呈负相关，Per2可能对肝癌干细胞的增殖起抑制作用。