脂肪间充质干细胞条件培养基诱导结肠癌HT29细胞凋亡*

胡继军 王 梅 方 静 马春梅 沈加裙 凃 星 陈文莹 杨 超

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)是成体干细胞中的一类常见干细胞，具有多向诱导分化潜能。脂肪来源间充质干细胞(Adipose Derived Mesenchymal Stem Cells，ASC)由于脂肪组织取材方便、易于分离和体外培养、供者损伤较小、应用不涉及道德伦理问题、ASC低表达主要组织相容性复合物(MHC) I类抗原及不表达MHC II类抗原、对宿主基本无免疫原性[1]等而用于抗肿瘤研究。

肿瘤作为发病率较高的一类恶性疾病，临床主要治疗方案为手术、化疗和放疗。鉴于很多肿瘤对常规化疗和放疗不敏感，有研究通过肿瘤生长微环境角度探讨治疗新策略[2]，包括调控有关细胞，如上皮细胞、成纤维细胞、MSC及各种炎性细胞水平及其病理生理作用[3]，其中有关MSC调节肿瘤微环境作用的报道逐渐增多，既有其抑制肿瘤生长作用的观察结果[4]，也有其促进肿瘤生长的实验报道[5]。我们通过收集培养ASC后上清液制备ASC条件培养基(ASC-Conditioned Medium，ASC-CM)再培养结肠癌HT29细胞，观察其对HT29细胞增殖和凋亡的影响，为MSC抗肿瘤作用提供部分实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验细胞：人结肠癌HT29细胞由华中科技大学同济医学院附属协和医院肿瘤中心惠赠，人ASC由华中科技大学同济医学院附属协和医院干细胞中心惠赠。

1.1.2主要试剂：改良Eagle培养基(Dulbecco's Modified Eagle Media: Nutrient Mixture F-12, DMEM/F12) (批号：AAJ207798)、胎牛血清(FBS)(批号：GXB0081)购自美国Hyclone公司；0.25%胰蛋白酶(批号：1748050)、100×青霉素和链霉素(批号：15140-122)购自美国Gibco公司；细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit-8，CCK-8)购自日本Dojindo公司(批号：CK-04)；Annexin-V 凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司(批号：KGA106)；SYBR Green PCR 试剂盒购自德国Qiagen公司(批号：145049083)；RNA提取试剂盒购自美国Omega公司(批号：R6834-01)；反转录试剂盒购自美国Thermo公司(批号：K1622)。

1.1.3主要仪器：流式细胞仪(型号：FACSCalibur，美国Becton Dickinson公司)；实时荧光定量PCR扩增仪(型号：ABI 7500，美国应用生物系统公司)

1.2 方法

1.2.1ASC-CM制备：取ASC置于T25细胞培养瓶中，用含10%FBS和1%青霉素和1%链霉素的DMEM/F12培养基培养至密度80%-90%，换用新鲜无血清 DMEM/F12，继续培养2天后，收集上清至15ml无菌离心管中，1 000rpm离心5min，吸取上清层至新的无菌离心管中，4℃保存。实验时37℃预温。

1.2.2人结肠癌HT29细胞培养及增殖抑制实验：置HT29细胞于10%FBS和1%青霉素和1%链霉素的DMEM/F12培养基、37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，待其生长密度达到90%时，0.25%胰酶消化后，收集细胞，离心去上清，加入含10%FBS和1%青霉素和1%链霉素的DMEM/F12培养基，配制成细胞浓度5×104个/ml悬液，在96孔板中每孔接种100μl，使细胞密度为5×103个/孔，边缘孔只加入DMEM/F12培养基。培养6h，待细胞完全贴壁，弃去原培养基，分为实验组和对照组(各6个复孔)，分别加入37℃预温的ASC-CM 100μl和DMEM/F12培养基100μl再培养HT29细胞，空白孔为DMEM/F12培养基，无HT29细胞。分别培养24h、48h及72h，每孔加入CCK-8试剂10μl，37℃继续培养2h，在酶标仪上检测各孔吸光度(OD值，测定波长450nm)表示其增殖率水平，并计算实验组HT29细胞增殖率[=(As-Ab)/(Ac-Ab)×100%，As:实验组各孔OD；Ac:对照组各孔OD；Ab:空白孔OD]，分析其与培养时间的相关性。

1.2.3HT29细胞凋亡检测：采用流式细胞术。将HT29细胞接种于10个T25细胞培养瓶中，在含10%FBS和1%青霉素和1%链霉素的DMEM/F12培养基、37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养，待其生长密度达90%时，弃去原培养基，平分为实验组和对照组(n均=5)，分别加入ASC-CM和DMEM/F12培养基培养48h，0.25%胰酶消化，收集细胞，PBS洗涤后离心，收集5×105个细胞于试管中，加500μl binding buffer 制成细胞悬液后，再加入Annexin V-FITC染液和PI染液，室温下避光孵育30min，上流式细胞仪于1h内检测完毕。结果判断：在流式散点图上，左下象限为Annexin V-FITC和PI双阴性的活细胞，右下象限为Annexin V-FITC阳性、PI阴性的凋亡细胞。

1.2.4细胞凋亡因子半胱天冬酶(Caspase)-3、Caspase-9、存活素(Survivin)及X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)mRNA表达：提取两组HT29细胞总RNA，将其反转录成cDNA，采用实时荧光定量PCR扩增cDNA，根据CT值计算mRNA的相对表达量。

(1)总RNA提取：取1.2.3中对照组及实验组培养48h的HT29细胞，按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。(2)cDNA制备：RNA和Oligo(dT)混合，70℃ 5min后，冰上1min；再加入dNTP、RNA酶抑制剂、反转录酶M-MLV和5×Buffer，混匀；37℃ 1h，85℃ 10min，反转录成cDNA，-20℃保存，备用。(3)荧光定量PCR检测：HT29细胞的几种mRNA引物和内参β-actin引物均由Invitrogen公司合成。各引物序列见表1。

表1 引物序列

PCR反应体系根据试剂盒说明书配制。包括SYBR Green Master Mix、上下游引物、无RNA酶水、DNA模板。PCR反应条件：95℃ 5min，此后95℃ 10s，60℃ 30s，循环40次。

PCR结果用扩增产物的荧光信号达到设定阈值时所经过的扩增循环次数(CT值)表示，并据此计算各凋亡因子的mRNA相对表达量[6]=2-Δ(CT目的基因-CT内参基因)。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 ASC-CM抑制HT29细胞增殖率

结果显示，实验组HT29细胞在ASC-CM培养24h的OD值与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，ASC-CM培养48h、72h的OD值水平实验组较对照组明显降低(均P<0.01)；实验组HT29细胞24h增殖率为90%±8%，48h增殖率为81%±7%，72h增殖率为57%±14%，即随ASC-CM培养时间延长，实验组HT29细胞增殖率逐渐下降，两者呈显著负相关(r=-0.974，P<0.01)。见表2和图1。

表2 两组HT29细胞培养不同时间增殖水平(OD值)比较均=6)

注：与对照组相同时点比较，1)P<0.01

图1 ASC-CM培养时间与HT29细胞增殖率的相关性曲线

2.2 ASC-CM诱导HT29细胞凋亡

实验组HT29细胞凋亡率为7.84%±2.52%，对照组为3.69%±0.73%，实验组明显高于对照组(t=3.409，P<0.01)，其流式检测结果散点图如图2。

图2 ASC-CM诱导HT29细胞凋亡流式检测散点图(n均=5)

2.3 ASC-CM对HT29细胞凋亡因子mRNA表达的影响

实验组HT29细胞Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达明显高于对照组(P<0.01)，而Survivin和XIAP mRNA表达明显低于对照组(P<0.01)，见表3。

表3 ASC-CM培养对HT29细胞凋亡因子mRNA表达的影响均=5)

注： 与对照组比较，1)P<0.01

3 讨论

MSC对肿瘤细胞效应的实验结果不尽相同，有研究显示，MSC能有效诱导肿瘤细胞凋亡[4]，显著抑制小鼠胶质瘤细胞生长、肿瘤血管形成[7]，以及由化学致癌剂3-甲基胆蒽和二乙基亚硝胺诱导产生的肺癌生长[8]；但另有实验表明，MSC可促进肿瘤细胞增殖[5]，诱导乳腺癌细胞转移[9]，还可能增强肿瘤细胞对化疗的耐药性[10]。表明MSC对肿瘤细胞的作用可能比较复杂，MSC的类型和来源，肿瘤细胞的种类，MSC在肿瘤微环境中与肿瘤细胞的相互作用都会使实验出现不同结果，因而也增加了相关研究的难度和挑战性。

本文参考有关实验报道，并结合我们前期的研究[11]，设计了针对结肠癌HT29细胞采用ASC-CM培养，观察和探讨ASC-CM抑制HT29细胞增殖的作用和诱导凋亡效应及其部分机制。结果表明，ASC-CM培养能够明显抑制结肠癌HT29细胞增殖，并随培养时间延长，增殖率逐渐降低；流式细胞术证实ASC-CM培养可明显增加HT29细胞凋亡率，而且凋亡诱导因子Caspase-3、Caspase-9 mRNA表达量显著上调，凋亡抑制因子Survivin和XIAP mRNA表达显著下调。

研究表明，XIAP可直接抑制凋亡起始因子Caspase-9 以及灭活效应因子Caspase-3[12]。Survivin可通过多条信号通道发挥抗凋亡作用[13]， 而核因子κB(NF-κB)通路活化是它们抗结肠癌细胞凋亡的关键途径[14]，抑制结肠癌细胞NF-κB通路活化，则有可能降低XIAP及Survivin表达，进而促进癌细胞凋亡。MSC可分泌多种细胞因子，包括白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-Ra)来调控肿瘤微环境中各种细胞的生理活动，如MSC通过分泌的IL-Ra即可阻断NF-κB通路，达到抑制黑色素瘤A375细胞增殖的效果。从本文实验结果分析我们所用ASC-CM，可能存在IL-1等功能性细胞因子，同样能够阻断HT29细胞的NF-κB通路，从而降低XIAP和Survivin表达，增强Caspase-3和Caspase-9活性，提高HT29细胞凋亡率。而且，Visweswaran等[16]采用ASC-CM培养乳腺癌MCF-7 和 MDA-MB-231细胞，也发现癌细胞增殖下降，凋亡增加，Caspase-3表达增加，并认为ASC-CM的上述作用可能通过Wnt信号通路来抑制Survivin，上调Caspase-3表达得以实现。Yu等[17]利用ASC-CM培养膀胱癌EJ和T24细胞，也观察到癌细胞凋亡增加，Caspase-3表达升高的结果，并分析其与3-磷脂肌醇激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路的激活有关[15]。这些均与本研究中ASC-CM培养结肠癌HT29细胞效应和机制有较好的一致性，说明ASC对抗肿瘤生长有积极作用。

综上所述，ASC-CM体外培养人结肠癌HT29细胞可抑制其增殖，增加其凋亡。HT29凋亡机制与Caspase-3、Caspase-9 mRNA水平升高和Survivin、XIAP mRNA水平降低有关。该研究为ASC对肿瘤的细胞治疗和机制治疗提供了一定的实验依据。但由于肿瘤的表现和机制以及MSC与肿瘤的相互作用十分复杂，尚需更多更全面深入的相关研究，方能真正发挥MSC在肿瘤治疗中的重要作用。

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本文第一作者简介：

胡继军(1969-)，男，汉族，副主任技师，主要从事免疫检验工作

1 Uccelli A, Moretta L, Pistoia V. Immunoregulatory function of mesenchymal stem cells[J]. Eur J Immunol, 2006, 36(10): 2 566-2 573.

2 Koontongkaew S. The tumor microenvironment contribution to development, growth, invasion and metastasis of head and neck squamous cell carcinomas[J]. J Cancer, 2013, 4(1): 66-83.

3 Zischek C, Niess H, Ischenko I, et al. Targeting tumor stroma using engineered mesenchymal stem cells reduces the growth of pancreatic carcinoma[J]. Ann Surg, 2009, 250(5): 747-753.

4 Clarke MR, Imhoff FM, Baird SK. Mesenchymal stem cells inhibit breast cancer cell migration and invasion through secretion of tissue inhibitor of metalloproteinase-1 and -2[J]. Mol Carcinog, 2015, 54(10): 1 214-1 219.

5 Beckermann BM, Kallifatidis G, Groth A, et al. VEGF expression by mesenchymal stem cells contributes to angiogenesis in pancreatic carcinoma[J]. Br J Cancer, 2008, 99(4): 622-631.

6 Schmittgen TD, Livak KJ. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method[J]. Nat Protoc, 2008, 3(6):1 101-1 108.

7 Ho IA, Toh HC, Ng WH, et al. Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells suppress human glioma growth through inhibition of angiogenesis[J]. Stem Cells, 2013, 31(1): 146-155.

8 Liu T, Zhu K, Ke C, et al. Mesenchymal stem cells inhibited development of lung cancer induced by chemical carcinogens in a rat model[J]. Am J Transl Res, 2017, 9(6): 2 891-2 900.

9 Gonzalez ME, Martin EE, Anwar T, et al. Mesenchymal stem cell-induced DDR2 mediates stromal-breast cancer interactions and metastasis growth[J]. Cell Rep, 2017, 18(5): 1 215-1 228.

10 Devarasetty M, Wang E, Soker S, et al. Mesenchymal stem cells support growth and organization of host-liver colorectal-tumor organoids and possibly resistance to chemotherapy[J]. Biofabrication, 2017, 9(2): 21 002.

11 Yang C, Lei D, Ouyang W, et al. Conditioned media from human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells and umbilical cord-derived mesenchymal stem cells efficiently induced the apoptosis and differentiation in human glioma cell lines in vitro[J]. Biomed Res Int, 2014, 2014:109 389.

12 Savitskaya MA, Onishchenko GE. Mechanisms of apoptosis[J]. Biochemistry (Mosc), 2015, 80(11):1 393-1 405.

13 Jaiswal PK, Goel A, Mittal RD. Survivin: A molecular biomarker in cancer[J]. Indian J Med Res, 2015, 141(4):389-397.

14 Moto K, Maeda S, Hikiba Y, et al. Constitutive NF-κB activation in colorectal carcinoma plays a key role in angiogenesis, promoting tumor growth[J]. Clin Cancer Res, 2009, 15(7):2 248-2 258.

15 Zhang J, Hou L, Zhao D, et al. Inhibitory effect and mechanism of mesenchymal stem cells on melanoma cells[J]. Clin Transl Oncol, 2017, 19(11):1 358-1 374.

16 Visweswarana M, Arfusoa F, Dilley RJ, et al. The inhibitory influence of adipose tissue-derived mesenchymal stem cell environment and Wnt antagonism on breast tumour cell lines[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2018, 95(2):63-72.

17 Yu X, Su B, Ge P, et al. Human adipose derived stem cells induced cell apoptosis and S phase arrest in bladder tumor[J]. Stem Cells Int, 2015, 2015:619 290.