HPV阳性与阴性宫颈病变患者外周血中Foxp3 mRNA及RORγt mRNA的表达*

张 伟 蔡小凤 汪宏良 朱杰稳 肖 苏 黄 炜 胡 芳 尚小玲

宫颈癌(Cervical Cancer，CC)是全球女性发病率居第二位的恶性肿瘤[1]。很多研究[2，3]表明，90%以上宫颈癌与HPV感染有关。HPV的持续感染能否引起宫颈病变的发生发展与感染者自身的免疫状态、激素分泌水平等因素有关，其中宿主的免疫状态在HPV介导的致癌作用中发挥关键作用[4]。调节性T细胞(Treg)与辅助性T细胞17(T helper cell 17, Th17)在机体免疫调节和免疫耐受中发挥重要作用[5]，同时，Treg介导的肿瘤细胞逃逸机制及Th17细胞的失衡可能是宫颈病变发生发展的重要原因，而叉头状转录因子(Foxp3)和视黄酸相关孤儿受体γt(RORγt)分别是它们高表达的特异性转录因子[6]，推测这两种转录因子在宫颈病变中起着重要作用。

1 资料与方法

1.1 对象与分组

2016-01—2017-06来鄂东医疗集团市中心医院门诊及住院的宫颈病变患者373例，采用聚合酶链式反应(PCR)和基因芯片检测技术对送检者宫颈脱落细胞标本进行HPV基因分型检测，筛选出HPV阳性者158例，HPV阴性者215例，再依据不同疾病分为若干亚组。宫颈炎、宫颈上皮内瘤变分级(CIN)、宫颈癌的诊断根据妇产科学第七版诊断标准[7]。随机选取在黄石市中心医院同期健康体检女性39例为正常对照组，无HPV感染、无自身免疫性疾病及其它恶性肿瘤，肝肾功能、血尿常规及白带分泌物检查均正常。疾病各组与正常对照组年龄差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组一般资料比较

1.2 仪器与试剂

基因扩增检测系统(ABI 7500型),美国应用生物系统公司；分子杂交仪(LF-Ⅲ型),上海比朗仪器制造有限公司；HPV基因分型试剂盒(批号：16A001),广东凯普生物；总RNA提取试剂盒(批号；2016001),武汉百翌博科技有限公司提供；RNA纯化试剂盒(批号：20160102):武汉百翌博科技有限公司提供；cDNA合成试剂盒(批号：2016100010),武汉百翌博科技有限公司提供；热启动荧光定量PCR核心试剂盒(批号：001-25-2016),武汉百翌博科技有限公司提供；Foxp3基因、RORγt基因和内参基因β肌动蛋白(β-actin)引物：宝生物工程(大连)有限公司合成(表2)。

表2 检测基因与对应的引物序列

1.3 方法

1.3.1HPV分型检测：由妇科医生利用HPV专用采样刷采取标本后置于有标记的专用细胞保存液中。离心去上清加树脂颗粒提取液200μl充分混匀，100℃煮沸15min，高速离心5min，取上清液5μl 加入含通用引物的PCR混合液中,总体系 25μl。扩增条件：50℃ 15min; 95℃ 10min ;94℃ 30s,42℃90s, 72℃30s, 35个循环后72℃延伸 5min。将标记好的基因芯片膜条及扩增的PCR产物加入6ml A 液(2×SSC,0.1%十二烷基磺酸钠(SDS , pH7.4)沸水浴10min, 使 DNA变性，用于基因芯片检测，操作按试剂盒说明书进行。通过显色判断HPV阳性或阴性。

1.3.2Foxp3 mRNA和RORγt mRNA检测：(1)人外周血单个核细胞(PBMC)的分离：无菌条件下采集受试对象肘静脉血3ml于EDTA-K2抗凝管中，6h内用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法获取PBMC，—80℃冰箱保存备用。(2)PBMC总RNA提取及浓度、纯度测定：取冻存PBMC室温下自然解冻，4℃ 8 000r/min 离心 2min，弃上清液，加入1ml RNAisoTMPlus，充分振荡混匀后，严格按照说明书操作步骤进行。取RNA 溶解液置于紫外分光光度仪中进行RNA浓度测定，读取260nm与280nm的A值，利用A260/A280的比值(R)估计核酸的纯度，R值范围控制在1.8—2.0。(3)逆转录合成cDNA：按照试剂盒说明书分两步进行，首先除去基因组DNA，依次加入gDNA Eraser Buffer 2μl、gDNA Eraser 1μl、RNA 1μg，用RNase Free dH2O调整成10μl反应液，42℃静置2min后进行逆转录。逆转录反应体系20μl：PrimeScript Buffer 4μl，PrimeScript RT Enzyme MixⅠ1μl，RT Prime Mix 1μl，第一步制成的 10μl反应液，RNase Free dH2O 4μl。采用ABI7500型基因扩增仪进行逆转录，反应条件:37℃ 15min， 85℃ 5s。将合成的cDNA 置于-20℃保存。(4)实时荧光定量PCR：实验步骤参照 SYBR green荧光定量 PCR 试剂盒说明书进行。整个反应液的配置在冰上进行。 反应体系25μl∶SYBR Premix Ex TaqTM12.5μl(使用过程中注意避光)，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl (终浓度达 到0.2μmol/L)，DNA模板2μl (cDNA溶液)，ddH2O(灭菌蒸馏水)9.5μl。反应条件如下:预变性95℃ 30s。两步法PCR反应:变性 95℃ 5s，退火/延伸 60℃ 30s，35 个循环。(5)计算检测指标的相对表达量：得到每个PCR反应管不同指标的Ct值后，根据公式2-△△Ct计算出所测指标的相对表达量。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 不同宫颈病变HPV感染状况

不同宫颈病变的HPV感染率差异有统计学意义(P<0.05)；且有随着宫颈病变程度的逐渐加重，HPV感染率呈逐渐增高的趋势(r=0.712，P均<0.05),见表3。

表3 不同宫颈病变中HPV感染率(n，%)

2.2 HPV阳性和阴性患者FOXP3 mRNA和RORγt mRNA表达状况

2.2.1各组FOXP3 mRNA表达比较：HPV阴性的各组宫颈病变患者Foxp3 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。HPV阳性的各组宫颈病变患者Foxp3 mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)；宫颈炎组与CINI级组Foxp3 mRNA相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；其余各组呈CINI级组

表4 各组FOXP3 mRNA表达比较

注：与CINⅠ级组比较，1)P<0.05；与CINⅡ级组比较，2)P<0.05；与CINⅢ级组比较，3)P<0.05

2.2.2各组RORγt mRNA表达比较：HPV阴性的各组宫颈病变患者RORγt mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)HPV阳性的各组宫颈病变患者RORγt mRNA表达差异有统计学意义(P<0.05)；宫颈炎组与CINI级组RORγt mRNA相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)；其余各组呈CINI级组>CINⅡ级组>CINⅢ级组>宫颈癌组，差异有统计学意义(P均<0.05)。见表5。

表5 各组RORγt mRNA表达比较

注：与CIN I级组比较，1)P<0.05；与CIN Ⅱ级组比较，2)P<0.05；与CIN Ⅲ级组比较，3)P<0.05

2.3 Foxp3 mRNA、RORγt mRNA相对表达水平与宫颈病变严重程度的相关性

相关性分析结果显示，HPV阴性的各组宫颈病变患者Foxp3 mRNA、RORγt mRNA相对表达水平与宫颈病变严重程度无明显相关性(r=0.131、-0.068，P均>0.05)。HPV阳性各组宫颈病变患者中，Foxp3 mRNA的相对表达水平与宫颈病变严重程度呈显著正相关(r=0.697，P<0.05);RORγtmRNA的相对表达水平与宫颈病变严重程度呈显著负相关(r=-0.657，P<0.05)。

3 讨论

HPV是引起宫颈病变的主要原因，尤其是CIN和宫颈癌[8]。HPV持续感染可导致基因的不稳定表达，使细胞增殖加强，凋亡衰减，从而促进局部瘤变新生血管的生成，进而侵犯组织基底膜，是引诱宫颈癌变的关键[9]。

本实验研究了373例受试者，其中HPV阳性者158例，感染率为42.35%(158/373)。随着宫颈病变程度的逐渐加重，HPV阳性感染率亦逐渐增高(P<0.05)。反映出HPV感染与宫颈病变的进展有关。因此，应当重视HPV的筛查工作，发现阳性患者，并及时给以正确的干预，可有效的减轻宫颈病变的进一步发展。

目前国内外研究表明，HPV感染以及宫颈病变发生发展均与人体的免疫功能密切相关，特别是与T淋巴细胞的关系最为密切[10]。正常人外周血和脾脏组织的CD4+T细胞中约有5%—10%的细胞高表达CD25分子，称之为CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)[11]。Treg细胞是CD4+T淋巴细胞的一个亚群，对维持机体免疫的稳定性起着重要的调节作用[12]。特异性高表达转录因子Foxp3[13]；Foxp3在B细胞和CD8+γT细胞中无明显表达，在天然CD4+CD25-细胞和非成熟的胸腺细胞中亦不表达，而仅在胸腺和外周血的CD4+CD25+T细胞中表达，可作为 Treg 细胞的一个特异标志[14]。 近年来研究[15]认为，Treg细胞是形成免疫耐受的关键成分，是重要的免疫抑制细胞。在免疫耐受的形成与维持过程中，Th17细胞也起着十分重要的作用，主要参与机体的免疫炎症性反应调节。RORγt是Th17细胞特异性转录因子，在分化成熟的Th17细胞中高表达，对Thl7细胞的分化起关键作用，是控制Thl7细胞分化的特异性转录因子[16]。在正常的生理情况下，Treg 细胞与Th17细胞的功能表现为抑制炎症和促进炎症，互为抑制，共同调节机体的免疫平衡，维持免疫稳态。但是，当Treg细胞减少或Th17细胞增多时，其介导的炎症反应则会加强，发挥免疫负性调节的Treg细胞不足以抑制炎症反应时，免疫稳态就会被破坏，导致疾病的发生。

Foxp3和RORγt作为两个细胞亚型的特异转录因子，两者的表达情况也日益受到关注。本研究发现，随着宫颈病变程度的加重， Foxp3 mRNA的相对表达量逐渐升高，而RORγt mRNA的相对表达量呈降低趋势。一方面证实了Foxp3和RORγt参与了宫颈病变免疫的调节；同时，二者在病变发展的免疫调节中相对表达量呈负相关，Foxp3 mRNA的相对表达量升高、RORγt mRNA的相对表达量降低则会导致病变的发生，增加病变恶变的发生几率。另一方面也证实了HPV感染的宫颈病变在疾病的恶变过程中机体细胞免疫平衡存在着从Th17向Treg方向的偏移，表明Th细胞亚群之间的失衡与宫颈病变的发展存在关联。

综上所述，Foxp3和RORγt在宫颈病变发展进程中起着重要作用。通过检测外周血Foxp3 mRNA和RORγt mRNA的相对表达水平可以推测机体在疾病变化中的免疫状态，从而预测病变的变化动向，为患者预后评估及临床治疗开辟了新思路。

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本文第一作者简介：

张伟(1986-)，男，汉族，主管技师，主要从事临床免疫学检验与教学

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