转染HBx改变Notch信号诱导肝癌HepG2细胞株多药耐药性研究

徐桐红，于冬艳，任 玲

肝癌多药耐药(MDR)是影响化疗效果及导致死亡的主要原因[1-2]。肝癌对化疗药物相对不敏感，对MDR发生机制不清楚。HBx具有多种调控功能，可激活肿瘤侵袭相关原癌基因和转录因子，是肝癌发病独立危险因素[3-5]。Notch信号通路是高度保守的细胞间信号转导通路。研究表明，Notch信号通路不仅对胚胎期肾脏发育起至关重要的作用，且参与多种肿瘤的发生和发展[6]，其能通过血管内皮生长因子促进肿瘤血管发生，从而促进肿瘤细胞增殖[7]。多药耐药蛋白(MRP)过表达是肝癌产生MDR的重要机制[8-9]。本研究采用基因转染将HBx基因转入肝癌HepG2细胞中，观察HBx对HepG2细胞中Notch信号通路和MRP表达的影响，并探讨转染HBx对肝癌细胞增殖和MDR的影响及其可能的作用机制，为肝癌的防治提供理论基础。

1 材料与方法

1.1细胞株 人肝癌HepG2细胞株购自中科院上海生命科学院细胞库，本所传代保存，置于37℃、CO2体积分数为5%、含10%胎牛血清RPMI-1640培养基(Thermo Fisher Scientific，MA，USA)的恒温培养箱内培养。

1.2试剂 DMEM高糖细胞培养液(美国Gibco公司，批号：12100046)，DMEMF12(美国Gibco公司，批号：12400024)，HBSS缓冲液(上海研卉生物技术有限公司，批号：BS0101)，Trizol裂解液(美国赛默飞世尔科技，批号：15596026)，Taqman MicroRNA反转录试剂盒(美国赛默飞世尔科技，批号：4366596)，Lipofectamine 2000转染试剂盒(美国赛默飞世尔科技，批号：722255)，Annexin-V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(上海前尘生物科技有限公司，批号：40302ES20)，B27补充剂(美国GIBCO，批号：17504-044)，CCK-8试剂盒(上海钰博，批号：YB1198)，小牛血清(北京索莱宝公司，批号：01-045)，胰蛋白酶(北京瑞达恒辉科技发展有限公司，批号：HB-0103-01)，RPMI-1640培养基(美国GIBCO公司，批号：11875-093)。

1.3实验方法

1.3.1重组X质粒转染肝癌HepG2细胞：在10%胎牛血清的DMEN中培养HepG2细胞，胰酶消化后，接种于直径25 cm培养瓶中，此时计数细胞数为1×106个/L，细胞在6 h后贴壁，之后进行细胞转染。在37℃预热的无血清培养基加入5 μg DNA和15 μl Trans Fast Reagent，随机高速涡旋混匀，在室温下静置15 min。培养基被小心移出，之后慢慢向培养瓶中加入混匀的DNA/脂质体的混合物，在37℃孵育24 h后，轻轻加入4 ml含血清的培养基(完全培养基)，不必移去DNA/脂质体混合物，37℃继续孵育48 h；以HepG2细胞中转染重组x质粒命名为转染HBx细胞组(HepG2-HBx组)、未转染重组x质粒命名为转染空载体细胞组(HepG2-con组)，未进行任何处理的为空白细胞组(HepG2组)。

1.3.2实时定量聚合酶链反应(PCR)检测HBx mRNA的表达：TRIzol试剂提取并收集处于对数生长期的3组肝癌HepG2细胞的HBx mRNA，RNA完整性利用1%的琼脂糖变性凝胶电泳进行检测，纯度和浓度利用紫外可见分光光度计检测；在70℃(10 min)、冰育(2 min)、42℃(60 min)、70℃(10 min)反应条件下，利用逆转录试剂盒逆转录得到cDNA；在95℃(5 s)、60℃(20 s)、72℃(5 s)进行qRT-PCR反应，40个循环，重复试验3次。

1.3.3蛋白免疫印迹法(Western-blot)检测肝癌HepG2细胞中HBx、Notch-1和MRP表达：转染组和未转染组进行细胞总蛋白提取，通过Bradford方法调整相同的蛋白浓度后，行电泳获得根据分子量分离的蛋白条带，根据pierce公司Western-blot试剂盒的指导说明进行，蛋白NC膜电转，进行蛋白封闭和一抗结合，一抗结合后洗脱，再进行二抗孵育标记兔抗大鼠的多克隆抗体。ECL试剂盒显色后，暗室发光拍照，以β-actin为内参进行系统软件分析。

1.3.4CCK-8法检测细胞增殖活性：取3组细胞以1×106个/L接种于96孔板中，每孔100 μl，培养48 h后每孔加入10 μl CCK-8试剂，4 h后在450 nm波长下检测各孔吸光度(OD)值，重复3次取均值。以OD值为纵坐标，时间为横坐标，绘制生长曲线。

1.3.5流式细胞仪检测细胞周期：收集转染48 h后的3组细胞，用冷PBS洗涤细胞后加入体积分数70%冷乙醇固定过夜。采用Cell Quet软件分析细胞周期分布情况。实验重复3次。

1.3.6细胞耐药性检测：将3组处于对数生长期的HepG2细胞制成浓度为1×106个/L的细胞悬液，每孔100 μl，接种于96孔板，每孔设3个复孔。孵育24 h后，换用浓度为0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L丝裂霉素、阿霉素培养液，0.5、1、2.5、5、10、25、50、100、250、500 μmol/L 5-氟尿嘧啶、顺铂、奥沙利铂培养液。孵育48 h后，去除含药液，每孔加100 μl不含药培养基和10 μl CCK-8，设空白孔。孵育2 h后，酶标仪测光密度值，设a为加药组的OD值，b为不加药细胞组的OD值，c为无细胞的空白组的OD值，药物对细胞的抑制率(%)=[1-(a-c)/(b-c)]×100%。计算5种药物抑制率为50%的浓度(IC50)和耐药指数(RI)，RI=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50。

2 结果

2.1HBx mRNA的表达 将PCR扩增产物进行凝胶电泳，可见HepG2-HBx组有目的片段出现，而其他2组未见HBx mRNA的表达，见图1。

图13组肝癌细胞HepG2聚合酶链反应扩增产物凝胶电泳结果
A.HepG2组；B.HepG2-con组；C.HepG2-HBx组

2.2HBx、Notch-1和MRP蛋白表达 HepG2-HBx组有HBx蛋白表达，HepG2组和HepG2-con组未见表达。Notch-1和MRP蛋白在HepG2-HBx组条带最大，HepG2-con组次之，HepG2组最小。见图2。

图23组肝癌HepG2细胞中HBx、Notch-1和多药耐药蛋白的表达情况

A.HepG2组；B.HepG2-con组；C.HepG2-HBx组

2.3转染HBx后各组细胞的生长曲线 与HepG2组和HepG2-con组比较，HepG2-HBx组细胞增殖显著加快(P<0.05)。见表1。

表1 3组肝癌HepG2细胞培养不同时间吸光度值比较

注：与HepG2组比较，aP<0.05，bP<0.01；与HepG2-con组比较，cP<0.05

2.4转染HBx后细胞周期变化 与HepG2组和HepG2-con组比较，HepG2-HBx组G0/G1期细胞显著减少，S期细胞增加(P<0.05，P<0.01)，G2/M期细胞变化不大(P>0.05)。见表2。

2.5耐药性 与HepG2组和HepG2-con组比较，HepG2-HBx组中肝癌细胞HeG2对5种药物耐药指数增高(P<0.05，P<0.01)。见表3。

表2 3组肝癌HepG2细胞周期变化情况,%)

注：与HepG2组比较，aP<0.05，bP<0.01;与HepG2-con组比较，cP<0.05，dP<0.01

表3 3组肝癌HepG2细胞对药物的敏感性比较

注:IC50为药物抑制率为50%的浓度，RI为耐药指数；与HepG2组比较，aP<0.05，bP<0.01；与HepG2-con组比较，cP<0.05，dP<0.01

3 讨论

HBV慢性感染是世界范围内原发性肝细胞癌(HCC)的主要发病原因之一[10-11]，HBx基因致HCC发生的机制是目前研究的热点。HBx基因具有强大的生物学功能，包括反式激活病毒基因组和宿主细胞基因的转录、增强转录因子DNA结合特性、抑制p53蛋白活性、参与细胞信号转导途径和细胞凋亡的调节等。这些功能可能与HCC的发生具有密切的关系[12]。一些体内及体外研究也发现，HBx可诱导细胞的恶性转化，甚至参与癌变发生[13]。

在肿瘤的发生、发展过程中，Notch信号出现紊乱时，能够直接引起肿瘤的发生和发展，且可通过多条信号通路的相互作用，间接诱导肿瘤的形成[14]。本研究qPCR检测结果显示，转染HBx的HepG2细胞内HBx mRNA和蛋白表达明显，提示转染构建过表达HBx的肝癌细胞成功。本研究还发现，转染HBx人肝癌HepG2细胞Notch-1蛋白表达高于HepG2组和HepG2-con组，提示HepG2细胞中HBx过表达诱导了细胞内Notch-1表达水平的增加，造成细胞内Notch信号通路的紊乱。细胞增殖和周期检测结果显示，转染HBx后细胞增殖能力显著提高，S期细胞增加，提示Notch-1的活化诱导了HepG2细胞增殖的发生。

MDR是导致肿瘤治疗失败和复发的主要原因之一[15-16]。有报道指出，检测患者体内MRP的表达可以作为监测恶性肿瘤细胞原发性耐药的主要指标[17]。肿瘤细胞产生MRP与药物外排泵ABC转运蛋白的过度表达与细胞凋亡水平异常改变、细胞DNA修复活性增强、胞内酶异常改变和器官微环境改变有密切关系[18]。此外，Notch-1信号与肿瘤细胞MDR的形成有关，过表达Notch-1能增加与MDR相关的ABBCC1基因的表达，诱导MDR的发生[19]。本研究发现，转染HBx的HepG2细胞耐药指数明显增高，提示转染HBx HepG2细胞，可能通过诱导Notch-1和MRP的过表达，最终导致MDR的发生。此外，在本研究基础上检测Notch通路的活化情况及由此引起凋亡抑制蛋白livin表达，同时研究livin的表达后MDR相关蛋白表达的变化,并观察HBx、Notch通路活化、livin蛋白及MDR蛋白表达之间的相关性是下一步的研究重点，为乙型肝炎相关性HCC临床治疗提供新靶点。

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