水通道蛋白1，3在变应性鼻炎大鼠鼻黏膜的表达及促鼻内腺体分泌的研究

许敏达

变应性鼻炎是一种常见的耳鼻喉科疾病，其发病率高达30%[1-2],临床表现为喷嚏、鼻溢、鼻痒等症状。目前临床药物治疗效果欠佳，考虑可能与变应性鼻炎发生机制尚未阐明有关[3]。有研究表明，水通道蛋白(AQP)在维持机体液体转运平衡中起着极其重要的作用，而变应性鼻炎的高分泌性可能与AQP的表达异常有关[4-5]。本研究探讨AQP与变应性鼻炎的关系，并分析其在变应性鼻炎大鼠鼻黏膜的表达情况及对腺体分泌的影响，旨在为变应性鼻炎的治疗提供实验依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1实验动物及分组 健康清洁级健康大鼠40只购自第四军医大学实验动物中心，雌雄不拘，体重为200～300 g，将大鼠随机分为实验组和对照组，每组20只，动物的饲养过程均符合西安市实验动物管理规定。

1.2实验试剂及仪器 卵白蛋白(OVA)购自美国Sigma公司；AQP1,3抗体购自美国PE公司；SP免疫组化试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司；RM2145型切片机购自德国LEICA公司，奥林巴斯生物显微镜购自上海光学仪器五厂；电热恒温鼓风干燥箱购自上海姚氏仪器设备厂；HH-600-数显三用恒温水箱购自江苏省金坛市友联仪器研究所。

1.3实验方法

1.3.1模型制备:根据许海波[6]和李钦等[7]的方法进行造模。实验组以OVA经全身致敏并进行强化致敏，每天以1 mg/ml OVA滴鼻，对其进行激发，直至建立大鼠变应性鼻炎动物模型。具体操作步骤：将大鼠分组后，先适应性喂养1周。首先全身致敏：采用10%水合氯醛3 ml/kg对大鼠进行麻醉，并于大鼠左右前肢和后肢跖部皮下各一点注射0.2 ml和0.3 ml的抗原佐剂混悬液[每毫升含1 mg OVA，2 mg Al(OH)3]进行致敏。初次致敏5 d后开始强化致敏，在大鼠背部皮下10处注射0.5 mg OVA(溶于1 ml生理盐水)；自初次致敏后第7天起每天用1 mg/ml OVA滴鼻1次(含有OVA溶液均以生理盐水配制)，每次20 μl，并观察滴鼻后大鼠打喷嚏、搔鼻的次数及鼻塞情况，每次观察30 min，并记录。模型建立后沿中线打开鼻腔后，以小棉棒轻轻擦取鼻腔黏膜表面的黏液，做涂片后行免疫组化染色。

1.3.2模型制备成功标准:连续观察3～4周，并进行叠加积分评价动物模型，当积分>5分时表示成功造模[6]。对搔鼻和喷嚏次数分别进行统计并计分。0分:鼻塞正常,吸气明显，鼻翼扇动；1分:鼻塞,湿啰音可听到，且吸气明显，鼻翼扇动；2分:鼻塞，湿啰音明显，吸气明显，鼻翼扇动；3分：鼻塞，湿啰音明显，且出现次数较多≥2次。

1.4观察指标

1.4.1血清学检测：血清中Ca2+、K+、Na+和Cl-浓度应用间接电极的方法进行检测。

1.4.2免疫组化染色：AQP1,3的检测应严格按试剂盒说明操作(兔抗大鼠多克隆抗体)，实验中AQP的阳性对照用豚鼠肾脏做对比，阳性是肾小管上皮细胞胞浆中染色为褐色。本实验利用PBS来代替一抗作为阴性对照，采用Image-Pro Plus 6软件计算平均光密度值，计算表达面积的比值。

1.4.3鼻内腺体分泌率检测：大鼠麻醉后，在20℃下，用棉线着染段置于一侧鼻中段前下方黏膜处，静止不动，5 min后取下棉线，立即测量棉线荧光素染色长度，棉线吸收率为0.054 μl/min，测得荧光棉线染色长度(mm)乘以吸收率为鼻内腺体分泌量。

2 结果

2.1血清离子浓度 实验组血清Ca2+和K+浓度较对照组降低，Na+浓度较对照组升高(P<0.01)；两组血清Cl-浓度比较差异无统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2AQP1，3表达情况 两组大鼠AQP1，3在鼻黏膜中表达不等，见图1。对照组AQP1.3表达面积为(14.84±1.56)%，实验组为(21.32±2.43)%。实验组AQP1,3表达面积较对照组增加(P<0.05)。

表1 两组大鼠血清离子浓度比较

注：对照组为正常大鼠，实验组为变应性鼻炎模型；与对照组比较，bP<0.01

图1两组大鼠鼻黏膜水通道蛋白1,3表达情况(SP×200)

A.对照组；B.实验组

2.3鼻内腺体分泌情况 对照组鼻内腺体分泌量为(0.58±0.07)μl/min，实验组为(2.07±0.36)μl/min。实验组鼻内腺体分泌量高于对照组(P<0.05)。

3 讨论

变应性鼻炎模型的建立基本上都分为致敏阶段和激发阶段，但是对于模型建立过程中的细节，不同的研究单位和实验室有着不同的建模方案，本实验以OVA经全身致敏，强化致敏后，以1 mg/ml OVA每天滴鼻，进行激发，直至建立大鼠变应性鼻炎动物模型。

鼻黏膜受体可以与醛固酮发生结合作用，这种结合作用有效地降低内淋巴液中K+浓度,增加Na+浓度，以及由此通过K+浓度改变内、外淋巴液渗透压[7]。因此醛固酮的增加可上调大鼠鼻黏膜AQP1,3的表达水平，并与其结合，AQP1,3表达的增加可能会直接改变水在鼻内的分布状态，诱导水代谢失调，进而发生变应性鼻炎。本研究结果显示，实验组血清Ca2+和K+浓度低于对照组，Na+浓度高于对照组，提示变应性鼻炎的发生和AQP1,3的表达增加可能与机体醛固酮水平改变有关。

AQP1,3在不同组织表达部位的水平不同。有研究报道，AQP1,3在眼部的表达丰富：睫状体非色素上皮、小梁网内皮细胞、角膜内皮细胞、晶状体均有表达[8]。Stamer等[9]研究显示，AQP1,3可能参与眼房水形成，青光眼的发病可能与其表达失衡有关。AQP1,3也表达于脑脉络膜上皮微绒毛细胞顶质膜，参与了水液由血液进入脑脊液的主动转运过程，而且对大脑急性损伤时导致脑水肿的形成有重要作用[10]。AQP1,3在大鼠和人近端小管和髓袢降支上皮细胞的顶端和基底外侧膜均有表达[11-12]，并参与肾脏水液的重吸收，以及对渗透梯度的形成有重要作用。然而，AQP1,3并未在大鼠鼻咽或鼻甲表层上皮检测到，但在鼻咽上皮下毛细血管和小静脉及鼻甲中毛细血管和静脉窦表达水平较高[13]。AQP1,3在肝胆管内皮细胞基底外侧膜上及尿路上皮、鼻息肉中也有表达。本研究发现，AQP1,3在鼻黏膜上皮下成纤维细胞、毛细血管内皮细胞及血窦内皮细胞表达丰富；而在上皮细胞层、黏膜内腺体及导管均未见AQP1,3抗体标记，且实验组AQP1,3表达水平高于对照组。提示AQP1,3的增加可能会诱导了内淋巴的生成增多，导致变应性鼻炎的发生。 与江一鸣等[13]研究结果一致。

变应性鼻炎时，经变应原激发毛细血管通透性增加，腺体分泌增强是大量鼻涕产生的主要液体来源。本研究结果显示，实验组鼻内腺体分泌量高于对照组。提示AQP1,3的增加可能会诱导鼻内腺体活性增强，使其腺体分泌增加。 依据AQPs分布部位，AQP1,3表达增强，有利于上皮下组织液通过上皮层细胞，以及利于液体经腺细胞转运至腺管，促进大量鼻涕的产生，提示膜迷路积水的发生可能是由于AQP1,3表达增加诱导了内淋巴产生增多导致的，但其发病机制仍需要进一步探明。

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