miR-432对骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭的影响及机制

荣辉，王志臣，于兴胜，韩康

(济南军区总医院，济南250031)

miR-432对骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭的影响及机制

荣辉，王志臣，于兴胜，韩康

(济南军区总医院，济南250031)

目的探讨微小RNA-432(miR-432)对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其作用机制。方法采用qRT-PCR技术检测人骨肉瘤细胞MG-63、人成骨细胞hFOB1.19中miR-432表达。将对数生长期MG-63细胞随机分为三组，分别转染miRNA对照质粒(miR-NC组)、miR-432抑制质粒(miR-432 inhibitor组)及miR-432过表达质粒(miR-432组)，转染48 h时进行接种培养，分别检测细胞增殖(吸光度值)、迁移和侵袭情况。利用miRWalk和miRanda生物信息学软件预测miR-432靶基因可能为致癌基因CX3CL1，分别构建含有miR-432结合位点的CX3CL1基因3′-UTR区野生型(CX3CL1-wt)和突变型(CX3CL1-mut)荧光素酶报告载体。将MG-63细胞分别共转染CX3CL1-wt或CX3CL1-mut报告载体和miR-432载体(观察组)，并设置共转染miR-NC载体作为对照组。转染48 h时，采用双荧光素酶试剂盒检测相对荧光素酶活性。结果MG-63细胞中miR-432相对表达量低于hFOB1.19细胞(P<0.01)。miR-NC组、miR-432 inhibitor组、miR-432组细胞中miR-432相对表达量分别为1.00±0.01、0.47±0.03、3.62±0.03，组间比较P均<0.01。miR-432组培养24、36、48 h的细胞吸光度值均明显低于miR-NC组、miR-432 inhibitor组，miR-432 inhibitor组均明显高于miR-NC组。miR-432 inhibitor组及miR-432组细胞相对迁移率分别为(122±7)%、(65±4)%，相对侵袭率分别为(189±25)%、(49±11)%；上述指标组间比较P均<0.05。CX3CL1-wt和miR-432共转染MG-63细胞后，观察组相对荧光素酶活性低于对照组(P<0.05)；CX3CL1-mut和miR-432共转染细胞后，对照组和观察组相对荧光素酶活性分别为1.00±0.11、0.93±0.13，两组比较P>0.05。结论miR-432过表达可抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭，靶向调控致癌基因CX3CL1可能是其作用机制。

骨肉瘤；微小RNA-432；细胞增殖；细胞迁移；细胞侵袭；CX3CL1

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤，好发于20岁以下人群[1]，骨肉瘤约占原发性恶性骨肿瘤的30%，常在发病早期就发生侵袭和转移，其中肺转移约占所有转移的90%，亦可见肝、脑、肾等部位转移[2]。由于其发生远处转移早，对放化疗反应不敏感，患者5年生存率为50%～60%[1]。研究表明，微小RNA(miRNA)通过参与肿瘤相关基因转录后水平调控，对骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭等发挥重要作用[3,4]。miR-432作为新发现的与肿瘤相关的miRNA，在胃癌、肺癌、宫颈癌等组织或细胞中表达下调，且参与调控肿瘤生长、侵袭，但其与骨肉瘤发生、发展的关系报道较少[5]。前期研究发现，骨肉瘤组织中miR-432表达低于癌旁正常组织，提示miR-432表达下调可能参与了骨肉瘤的发生，但具体作用机制尚未明确[6]。2010年9月～2015年9月，我们观察了miR-432对骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响，现分析结果并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人骨肉瘤细胞株MG-63及人成骨细胞系hFOB1.19均购自中国科学院上海细胞库。FBS、DMEM培养基、青霉素、链霉素均购自美国Gibco公司。LipofectamineTM2000转染试剂、TRIzol、M-MLV逆转录酶购自美国Invitrogen公司。SsoAdvancedTMSYBR®Green Supermix试剂盒购自美国Bio-Rad公司。细胞增殖CCK-8试剂盒、双萤光素酶报告基因检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 细胞培养及分组处理 人骨肉瘤细胞MG-63及人成骨细胞系hFOB1.19均常规培养于含10% FBS的DMEM培养基(含100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。取对数生长期MG-63细胞以密度为5×105个/孔接种于6孔板。当细胞融合度达70%左右时随机分为三组，采用LipofectamineTM2000转染试剂分别转染miRNA对照质粒(miR-NC组)、miR-432抑制质粒(miR-432 inhibitor组)及miR-432过表达质粒(miR-432组)。转染48 h时，收集各组细胞用于后续实验。

1.3 相关指标观察

1.3.1 细胞miR-432表达 取对数生长期MG-63、hFOB1.19细胞以及转染48 h的三组细胞，采用qRT-PCR法检测miR-432相对表达量。具体步骤：TRIzol法提取组织和细胞总RNA；采用miR-432特异性逆转录引物，以M-MLV逆转录酶逆转录合成cDNA；以U6作为内参，使用SsoAdvancedTMSYBR®Green Supermix试剂盒进行qRT-PCR。反应条件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s、62 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40个循环；72 ℃延伸10 min。采用2-ΔΔCt法计算miR-432相对表达量。

1.3.2 细胞增殖情况 采用CCK-8法检测。将转染48 h的三组细胞接种于96孔板(2×103个/孔)，分别在培养0、12、24、36、48 h时每孔加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育2 h，检测450 nm波长处的吸光度(A)值。每组设置3个复孔，实验重复3次，结果取平均值。

1.3.3 细胞迁移情况 采用细胞划痕实验。将转染48 h的三组细胞接种于24孔板中(1×105个/孔)，培养24 h时采用200 μL无菌移液器枪头在培养板底部进行“1”字形划痕，倒置显微镜下观察36 h时划痕中细胞的迁移情况，计算细胞相对迁移率(相对于miR-NC组)。每组设置3个复孔，实验重复3次，结果取平均值。

1.3.4 细胞侵袭情况 采用Transwell侵袭实验。采用预铺Matrigel基质胶的8 μm聚碳酸酯滤膜培养小室进行Transwell实验。将转染48 h的三组细胞以2.0×105个/孔接种于100 μL无血清培养基中，下室加入500 μL含10% FBS的DMEM培养液，每组设3个复孔。在37 ℃、5% CO2条件下培养36 h，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，PBS洗涤2次，4%多聚甲醛固定细胞10 min，0.1%结晶紫染色5 min。100倍显微镜下随机计数5个视野的细胞数，取平均数作为每组穿过小室细胞数，计算细胞相对(相对于miR-NC组)侵袭率。

1.3.5 miR-432下游靶基因确定 利用miRWalk和miRanda生物信息学软件对miR-432靶基因进行预测，结果显示miR-432与致癌基因CX3CL1的3′-UTR存在7个碱基结合位点。分别构建含有miR-432结合位点的CX3CL1基因3′-UTR区野生型(CX3CL1-wt)和突变型(CX3CL1-mut)荧光素酶报告载体。将处于对数生长期的MG-63细胞以密度为5×105个/孔接种于6孔板。当细胞融合度达70%左右时采用LipofectamineTM2000分别共转染CX3CL1-wt或CX3CL1-mut报告载体和miR-432载体(观察组)，并设置共转染miR-NC载体作为对照组。转染48 h时，采用双荧光素酶试剂盒检测相对荧光素酶活性。以萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性的比值表示相对荧光素酶活性。

2 结果

2.1 各组miR-432表达比较 MG-63细胞及hFOB1.19细胞miR-432相对表达量分别为0.53±0.02、1.00±0.04，两者比较P<0.01。miR-NC组、miR-432 inhibitor组、miR-432组细胞miR-432相对表达量分别为1.00±0.01、0.47±0.03、3.62±0.03，组间比较P均<0.01。

2.2 各组细胞增殖情况比较 miR-432组培养24、36、48 h的A值均低于miR-NC组、miR-432 inhibitor组，miR-432 inhibitor组均高于miR-NC组(P均<0.05)。见表1。

表1 三组细胞增殖情况比较

注：与miR-NC组同时间点比较，*P<0.05；与miR-432 inhibitor组同时间点比较，△P<0.05。

2.3 各组细胞迁移能力比较 miR-432 inhibitor组及miR-432组细胞相对迁移率分别为(122±7)%、(65±4)%，组间比较P均<0.05。

2.4 各组细胞侵袭能力比较 miR-432 inhibitor组及miR-432组细胞相对侵袭率分别为(189±25)%、(49±11)%，组间比较P均<0.05。

2.5 miR-432下游靶基因 CX3CL1-wt和miR-432共转染MG-63细胞后，对照组和观察组相对荧光素酶活性分别为1.00±0.13、0.52±0.18，两组比较P<0.05；CX3CL1-mut和miR-432共转染细胞后，对照组和观察组相对荧光素酶活性分别为1.00±0.11、0.93±0.13，两组比较P>0.05。

3 讨论

随着新的辅助化疗技术的应用，骨肉瘤患者生存率明显提高，但远处转移仍是骨肉瘤治疗失败的主要原因[6]。明确与骨肉瘤转移密切相关的分子，对于探讨骨肉瘤转移的启动机制、预防骨肉瘤转移的发生、选择合适的靶点进行干预和治疗具有重要意义。

miRNA已被证明通过靶向调控肿瘤相关基因mRNA表达，从而抑制或促进肿瘤细胞增殖、分化、侵袭及转移等过程[7,8]。研究发现，miR-432在卵巢癌、宫颈癌、垂体腺瘤等多种肿瘤组织中低表达，并对肿瘤的发生、发展发挥负性调控作用[9，10]。miR-432过表达可阻滞神经母细胞瘤细胞于G0/G1期，抑制细胞增殖，参与神经母细胞瘤的神经元分化过程[11]；miR-432在肝癌组织及细胞系中表达明显下调； miR-432过表达可抑制肝癌细胞增殖及其成瘤性，其作用机制可能为miR-432靶向调控Wnt/β-catenin信号通路[4]；但在黑色素瘤细胞中miR-432异常高表达[12]。目前仍无法明确miR-432是发挥抑癌基因还是癌基因的作用，推测miR-432的表达和功能可能具有肿瘤类别依赖性。本研究结果显示，骨肉瘤细胞中miR-432高表达；转染miR-432或miR-432 inhibitor来提高或降低MG-63细胞中miR-432表达后发现，过表达miR-432可抑制MG-63细胞增殖、迁移和侵袭，下调miR-432表达则促进MG-63细胞增殖和转移，表明miR-432在骨肉瘤细胞中可能发挥抑癌基因作用。

CX3CL1蛋白属于CX3C趋化因子家族成员，不仅具有趋化功能，还具有细胞黏附功能。研究发现，CX3CL1在卵巢癌、乳腺癌细胞中高表达，且其表达水平与肿瘤细胞增殖及转移密切相关[13]。在恶性程度较高的少突胶质细胞瘤中，CX3CL1表达水平与患者总体生存率呈负相关[14]。CX3CL1表达水平亦与前列腺癌转移及患者预后相关，当用中和性抗体阻滞CX3CL1表达后，前列腺癌细胞的骨转移明显减少[15]。在骨肉瘤细胞中CX3CL1表达较正常成骨细胞明显升高，其通过PI3K/Akt/NF-κB信号通路上调细胞间黏附分子1表达，从而介导骨肉瘤细胞转移[16,17]。本研究我们利用靶基因预测软件发现miR-432与CX3CL1基因3′-UTR区的结合位点，提示CX3CL1可能是miR-432的下游靶基因，并进一步通过双荧光素酶报告基因检测实验验证预测的可靠性。

综上所述，miR-432可能通过靶向调控CX3CL1而抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭；miR-432可作为骨肉瘤治疗的一个新靶点。

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韩康(E-mail： 2160952686@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.48.011

R738.1

A

1002-266X(2017)48-0037-03

2017-04-30)