雷帕霉素对自闭症仔鼠神经、社交行为及海马区BDNF、Bcl-2蛋白表达的影响

党媛媛，倪金凤，刘国玉，张洁，商艳朝

(唐山市妇幼保健院，河北唐山063000)

雷帕霉素对自闭症仔鼠神经、社交行为及海马区BDNF、Bcl-2蛋白表达的影响

党媛媛，倪金凤，刘国玉，张洁，商艳朝

(唐山市妇幼保健院，河北唐山063000)

目的探讨雷帕霉素对自闭症仔鼠神经、社交行为及海马区脑源性神经营养因子(BDNF)、Bcl-2蛋白表达的影响。方法将12只Wistar孕鼠分为对照组、丙戊酸钠组(模型组)和丙戊酸钠联合雷帕霉素组(观察组)，每组4只。模型组和观察组妊娠12.5天时腹腔注射丙戊酸钠(600 mg/kg)，对照组同期腹腔注射等量生理盐水；观察组腹腔注射丙戊酸钠(600 mg/kg)后，每天给予雷帕霉素(4 mg/kg)灌胃直至仔鼠断奶，每组仔鼠20只。仔鼠出生35天时，分别检测三组仔鼠神经行为(在中央区的活动时间和直立次数)、社交行为(社交行为时间及非社交行为时间)及海马区BDNF、Bcl-2表达。结果与对照组仔鼠比较，模型组及观察组仔鼠在中央区活动时间均增加，站立次数均减少；与模型组仔鼠比较，观察组仔鼠在中央区活动时间减少，站立次数增加；组间比较P均<0.05。与对照组仔鼠比较，模型组及观察组仔鼠社交行为时间均减少，非社交行为时间均增加；与模型组仔鼠比较，观察组仔鼠社交行为时间增加，非社交行为时间减少；组间比较P均<0.05。模型组仔鼠海马BDNF蛋白相对表达量低于对照组，Bcl-2蛋白相对表达量高于对照组；观察组仔鼠海马BDNF蛋白相对表达量高于模型组，Bcl-2蛋白相对表达量低于模型组；组间比较P均<0.05。结论雷帕霉素可改善丙戊酸钠自闭症仔鼠模型神经行为表现，提高其社交能力；促进海马区BDNF表达、抑制Bcl-2表达，调节神经元异常发育、促进细胞凋亡可能是其作用机制。

自闭症；雷帕霉素；神经行为；社交行为；脑源性神经营养因子；Bcl-2；仔鼠

自闭症又称孤独症，是一种广泛性发育障碍疾病，一般在婴幼儿期发病，主要表现为言语沟通障碍、社会交往(简称社交)障碍以及行为刻板等，发病机制尚未明确，其发病率为2/1 000～6/1 000[1]。脑源性神经营养因子(BDNF)属于神经营养因子家族成员，在各脑区均有分布，可调控神经系统发育，其生理功能紊乱或电信号传导障碍均可引起精神发育迟缓、自闭症、脑萎缩和阿尔茨海默病等脑部疾病[4,5]。神经细胞凋亡障碍可能是自闭症的发病机制之一[6,7]。目前临床上缺乏治疗自闭症的有效药物。研究发现，雷帕霉素对外伤性脑组织损伤及帕金森病等神经退行性疾病动物模型的神经元具有保护作用。2015年6月～2016年6月，我们观察了免疫抑制剂雷帕霉素对自闭症大鼠神经、社交行为及海马区BDNF、凋亡蛋白Bcl-2表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 成年清洁级Wistar大鼠24只，雌雄各半，雄性体质量为300～350 g、雌性体质量为200～250 g，均购自我院实验动物中心，许可证号：SYXK(冀)2015-0038。丙戊酸钠、BDNF、Bcl-2一抗及二抗均购自美国Sigma公司，雷帕霉素购自上海前尘生物科技有限公司。

1.2 动物分组及处理 将Wistar大鼠按雌、雄配对分养过夜，于次日清晨检查雌鼠有无阴栓，有阴栓者记为妊娠第1天，并将怀孕母鼠单独饲养。按照随机数字表法将孕鼠分为对照组、丙戊酸钠组(模型组)和丙戊酸钠联合雷帕霉素组(观察组)，每组4只孕鼠。模型组和观察组于妊娠12.5天时腹腔注射丙戊酸钠(600 mg/kg)，注射后每天予雷帕霉素4 mg/kg灌胃直至仔鼠断奶；对照组同期腹腔注射等量生理盐水。每组取仔鼠20只，均于出生23天时断奶。

1.3 仔鼠神经行为观察 在仔鼠出生后35天时，每组选择6只仔鼠进行神经行为学检测。被测试仔鼠的出生时间相差在24 h以内，体质量差别在15 g以内，且均为雄性，分笼饲养。测试前1天将仔鼠放入检测室内适应环境。测试时将仔鼠放入25 cm×25 cm×38 cm封闭箱内中央区(12 cm×12 cm)。对仔鼠行为进行摄像记录，应用Any-Maze软件统计仔鼠5 min内在中央区的活动时间和直立次数。

1.4 仔鼠社交行为观察 仔鼠出生35天时，每组选择6只仔鼠进行社交行为测试(被测试仔鼠选择标准同1.3)。测试前1天将仔鼠放入检测室内适应环境。测试时将仔鼠放入60 cm×60 cm×60 cm透明三室箱的中间小室内适应10 min。在左侧小室放入陌生(不来自上述三组)仔鼠，并用铁丝笼罩住；右侧小室放置空的铁丝笼；打开中间小室进入两小室的通道。对仔鼠行为进行摄像记录，应用Any-Maze软件统计仔鼠10 min内与陌生仔鼠交往时间(社交行为时间)及自梳理时间(非社交行为时间)。

1.5 仔鼠海马区BDNF、Bcl-2蛋白表达检测 采用Western blotting法。将出生35天的仔鼠(每组6只，仔鼠选择标准同1.3)断颈处死，立即分离左右侧海马，并将其迅速转移至预先液氮冷却的匀浆器皿中，将脑组织研磨均匀；滴加含PMSF(60 μL/mg)的蛋白裂解液，冰上裂解30 min；4 ℃ 12 000 r/min离心30 min，取上清进行SDS-PAGE电泳；将电泳分离后的蛋白转移至PVDF膜上，采用5%脱脂奶粉将转有蛋白的PVDF膜封闭2 h；分别加入BDNF、Bcl-2一抗，4 ℃过夜；PBS洗涤3次、每次5 min，加入二抗，室温孵育1 h；PBS洗涤3次、每次10 min，将PVDF膜放入显影液中显影，应用成像分析仪对PVDF膜上的蛋白条带进行成像，检测各条带的灰度值。以目的蛋白条带与内参(β-actin)条带灰度值的比值表示该样本蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组仔鼠神经行为比较 见表1。

表1 三组仔鼠在中央区活动时间和站立次数比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

2.2 各组仔鼠社会交往行为比较 见表2。

表2 三组仔鼠社交与非社交行为时间比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

2.3 各组仔鼠海马区BDNF、Bcl-2蛋白表达比较 见表3。

3 讨论

动物模型是研究自闭症的主要对象。目前常用的自闭症动物模型主要有病毒感染模型、Tsc1基因敲除模型和丙戊酸钠模型等[8]。丙戊酸钠动物模型在结构效度、表现效度、可信度以及重复性等方面均较好，且能较好地呈现自闭症的社交行为障碍、交流障碍以及行为重复刻板等临床特点，是公认的一种较为理想的自闭症动物模型[9]。本研究结果显示，模型组仔鼠在中央区活动时间明显长于对照组仔鼠，站立次数明显少于对照组仔鼠；模型组仔鼠社会交往能力明显低于对照组仔鼠，且不愿接触新事物，不愿与陌生鼠交往；提示丙戊酸钠制备的自闭症仔鼠神经行为学表现和社交行为能力均符合自闭症儿童的行为特点，模型制备成功。

表3 三组仔鼠海马区BDNF、Bcl-2蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，△P<0.05。

雷帕霉素是一种从链酶菌中提取的大环内酯类免疫抑制剂，临床主要应用于真菌感染、肿瘤以及器官移植排斥反应的治疗。研究显示，哺乳动物神经细胞内存在雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，雷帕霉素与mTOR特异性结合后可抑制mTOR的磷酸化和活性[12]，保护神经细胞，减少神经细胞损害[10]。研究提示，mTOR通路与神经元的异常活动可能有关[11]。敲除小鼠模型PTEN基因可激活mTOR通路，导致神经元胞体增大、电活动异常；应用雷帕霉素干预后，神经元电活动明显改善[13]。此外，雷帕霉素也可抑制TSC基因敲除小鼠星形胶质细胞的过度增殖，并可维持神经元微环境中兴奋性谷氨酸盐的稳定性[14]。本研究结果显示，给予雷帕霉素干预的仔鼠神经行为和社交能力明显改善，提示雷帕霉素可能用于预防或治疗自闭症。

BDNF主要由星形胶质细胞和神经元以自分泌和旁分泌的形式分泌，在脑组织的海马区、扣带前回、杏仁核以及皮质等区域含量较多[15]。研究显示，自闭症患者或动物模型海马区结构和功能的变化可能与BDNF表达下调有关[16]。海马区BDNF通过与其受体酪氨酸激酶B(TrkB)结合，导致该受体自磷酸化和包括丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的信号转导途径激活，从而促进与学习记忆相关的神经递质的合成和释放。另外，BDNF还可以结合位于突触后膜的TrkB受体，导致NMDA和AMPA谷氨酸受体激活，增加NMDA受体NR1和NR2B单元磷酸化水平以及AMPA受体亚单位GluR1和GluR2/3表达，增强突触传递效能[17]。BDNF表达下调的小鼠海马长时程增强(LTP)以及海马依赖性的学习与记忆能力都会受到一定损害[18]。有研究显示，雷帕霉素可促进过氧化氢(H2O2)及离子霉素联合去铁胺损伤作用下的星形胶质细胞存活，对线粒体膜电势具有保护作用，降低H2O2损伤作用下星形胶质细胞活性氧(ROS)的产生，并可维持细胞内线粒体ROS含量在较低水平[19]。本研究结果显示，模型组仔鼠海马区BDNF水平低于对照组，观察组仔鼠海马区BDNF水平高于模型组，提示雷帕霉素可上调自闭症大鼠海马区BDNF表达水平。

Bcl-2家族是调控细胞凋亡的主要基因家族，可抑制由多种细胞毒素所引起的细胞死亡。自闭症大鼠海马区神经细胞凋亡受到抑制，神经细胞增殖、分化和凋亡之间的平衡被打破，进而导致神经元数量增多、体积增大[20]。本研究显示，模型组仔鼠海马区Bcl-2蛋白表达明显高于对照组，观察组仔鼠海马区Bcl-2表达明显低于模型组，提示雷帕霉素可下调海马区Bcl-2表达，促进海马区神经元凋亡。雷帕霉素可抑制磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(AKT)/mTOR信号通路。P13K/AKT/mTOR信号通路在体内参与细胞增殖、分化和凋亡等过程，此信号通路激活可抑制细胞凋亡，mTOR活化能够使Bax表达降低，减弱其对Bcl-2蛋白抗凋亡和促增殖效应的拮抗作用，导致细胞增殖能力增强[21]。雷帕霉素可下调Bcl-2蛋白水平，通过与mTOR结合，抑制Bcl-2活性。

综上所述，雷帕霉素可改善丙戊酸钠自闭症仔鼠模型神经行为表现，提高其社交能力；促进海马区BDNF表达、抑制Bcl-2表达，调节神经元异常发育、促进细胞凋亡可能是其作用机制。

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