番茄碱对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及机制

宋佳，董翔，韩梅

(新疆医科大学附属肿瘤医院，乌鲁木齐830011)

番茄碱对胃癌细胞增殖和凋亡的影响及机制

宋佳，董翔，韩梅

(新疆医科大学附属肿瘤医院，乌鲁木齐830011)

目的观察番茄碱对胃癌细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其分子机制。方法体外培养胃癌BGC-823细胞，番茄碱组分别加入2.5、5、10 μmol/L番茄碱培养24 h；另设对照组，加入培养基培养24 h。采用CCK-8法检测算细胞增殖抑制率，流式细胞术检测细胞凋亡抑制率，Western blotting法检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达。结果番茄碱组加入2.5、5、10 μmol/L番茄碱培养24 h后，细胞增殖抑制率分别为21.21%±6.43%、42.51%±5.51%、63.71%±4.04%，均高于对照组的12.10%±2.33%；加入10 μmol/L番茄碱后细胞增殖抑制率最高(P均<0.05)。番茄碱组加入2.5、5、10 μmol/L番茄碱培养24 h后，细胞凋亡率分别为13.75%±1.02%、39.23%±1.48%、52.44%±2.02%，均高于对照组的1.52%±0.03%(P均<0.05)；加入10 μmol/L番茄碱后细胞凋亡率最高(P均<0.05)。番茄碱组加入2.5、5、10 μmol/L番茄碱后Bcl-2相对表达量均低于对照组，Bax相对表达量均高于对照组(P均<0.05)。结论番茄碱对胃癌细胞的增殖具有抑制作用，可促进细胞凋亡；其作用机制可能与调节凋亡相关基因Bcl-2、Bax蛋白表达有关。

番茄碱；胃癌；细胞增殖；细胞凋亡；Bcl-2蛋白；Bax蛋白

虽然胃癌化疗、手术治疗效果显著，但不良反应明显，医疗费用昂贵。因此，寻找有效、低毒、价廉的植物用药治疗胃癌意义重大。番茄中富含番茄红素、β-胡萝卜素、番茄碱等生物活性物质[2]。研究发现，番茄碱可参与肿瘤细胞增殖、凋亡、转移及耐药等多方面的调控，对多种肿瘤细胞和肿瘤动物移植瘤模型均有一定的抑制作用，如结直肠癌[3]、肝癌[3]、前列腺癌[4]、白血病[5]和乳腺癌[6]等，但其对人胃癌细胞作用的研究较少。2015年3月～2016年12月，我们通过体外实验观察番茄碱对人胃癌细胞增殖、凋亡的作用，探讨番茄碱抗肿瘤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 胃癌BGC-823细胞株购自武汉博士德公司；番茄碱购自同田生物公司；RPMI1640培养基、胎牛血清购自Hyclone公司；CCK-8试剂盒购自Dojindo公司；Annexin V-FITC/PI试剂盒购自BD公司；蛋白质提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒购自南京凯基生物科技有限公司；Bcl-2、Bax、GAPDH购自CST公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；蛋白质Marker购自Life公司。

1.2 细胞培养与分组处理 将胃癌细胞加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中，置于5%CO2、37 ℃培养箱中孵育。待细胞达到90%融合度时，用胰酶消化传代。取对数生长期的细胞，加入RPMI1640培养液，调整细胞密度为1×105/mL。将细胞接种于96孔板上，37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。待细胞完全贴壁后，将细胞分成两组，番茄碱组分别加入番茄碱2.5、5、10 μmol/L共培养24 h，另设培养基对照组，每组设3个复孔。

1.3 细胞增殖抑制率测算 采用CCK-8法。收集各组细胞，加入90 μL培养基和10 μL CCK-8试剂，置于培养箱中孵育1 h。使用酶标仪于450 nm处检测各组的吸光度A450值，重复实验3次。细胞增殖抑制率=[(对照孔A450-实验孔A450)/(对照孔A450-空白孔A450)]×100%。

1.4 细胞凋亡率测算 采用流式细胞术。收集各组细胞，PBS漂洗3次，按说明书分别加入Annexin V-FITC和PI试剂，30 min内上流式细胞仪(贝克曼MOFIOXDP)进行检测，利用FlowJo软件处理数据。

1.5 细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集各组细胞，加入含有PMSF的裂解液，4 ℃离心30 min。取上清液，BCA法测定蛋白浓度。参照说明书配置SDS-PAGE胶，常规电泳，转膜，封闭2 h，分别加入稀释后的一抗，4 ℃孵育过夜，TBST漂洗后加入二抗，室温孵育1 h，ECL发光显色。以目的条带与内参GAPDH条带灰度值的比值表示蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 两组细胞增殖抑制率比较 番茄碱组以2.5、5、10 μmol/L番茄碱作用于胃癌细胞24 h后，细胞增殖抑制率分别为21.21%±6.43%、42.51%±5.51%、63.71%±4.04%,均高于对照组的12.10%±2.33%(P均<0.05)，且随浓度增加作用更为显著。

2.2 两组细胞凋亡率比较 番茄碱组以2.5、5、10 μmol/L番茄碱作用于胃癌细胞24 h后，细胞凋亡率分别为13.75%±1.02%、39.23%±1.48%、52.44%±2.02%，均高于对照组的1.52%±0.03%(P均<0.05)，且随浓度增加作用更为显著。

2.3 两组细胞Bcl-2、Bax蛋白表达比较 番茄碱组以2.5、5、10 μmol/L番茄碱作用于胃癌细胞24 h后，随番茄碱浓度升高，Bcl-2表达降低，Bax表达升高，与对照组比较差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

表1 两组细胞Bcl-2、Bax蛋白相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

番茄碱是番茄根、茎、叶、青果中的天然成分，在番茄各部位含量各有不同。研究显示，随着番茄成熟度的增加，其番茄红素和番茄碱的含量呈负相关的。绿番茄中番茄碱的含量可达500 mg/kg，红番茄中番茄红素的含量最高。番茄碱不仅具有广泛的生物活性，对细菌、病毒、真菌、昆虫、其他植物、哺乳动物和人都具有显著的生物学作用；还具有广泛的药理学活性，可发挥抗菌[7]、降脂[8]、增强免疫力[9]、抗炎[10]等多种作用。

番茄碱具有低毒、天然、有效的特点。研究发现,番茄碱可参与肿瘤细胞增殖、凋亡、转移及耐药等多方面的调控，对多种肿瘤细胞和肿瘤动物移植瘤模型均有一定的抑制作用。体外研究显示,番茄碱可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡和抑制肿瘤细胞侵袭转移等多种途径，对多种实体瘤发挥抗肿瘤的作用[4,11]。Shieh等[12]研究表明，番茄碱可有效抑制人非小细胞肺癌细胞NCI-H460的转移侵袭能力，且其抑制效果具有明显剂量依赖效应。Lee等[4]研究显示,番茄碱可通过抑制IκBα激酶活性，导致IκBα磷酸化，IκBα发生降解从而影响NF-κB的活性；番茄碱还可抑制TNF-α诱导的NF-κB依赖的促生存蛋白，如Bcl-2、Bcl-xL、c-IAP和XIAP等，发挥促进凋亡的作用。针对肺腺癌的研究[13]显示，番茄碱可通过抑制PI3K/Akt或NF-κB通路的活性抑制细胞的增殖和迁移能力。本研究结果显示，番茄碱作用胃癌细胞24 h后，可显著抑制细胞增殖并促进其凋亡。

细胞过度增殖和凋亡受阻是肿瘤发生的重要原因之一，故抑制肿瘤细胞增殖和诱导细胞凋亡可作为治疗恶性肿瘤的切入点。目前已知的凋亡信号转导通路主要有3条：线粒体通路、死亡受体通路及内质网通路。而线粒体通路是最普遍的凋亡机制，是细胞凋亡的核心。Chao等[5]研究显示，番茄碱可通过上调Bak和Mcl-1s蛋白的表达，改变线粒体膜电位，诱导白血病K562和HL60细胞凋亡，但这一促凋亡作用并不依赖于Caspase级联反应的激活。Lee等[4]研究证实，番茄碱可降低前列腺癌PC-3细胞中Bcl-2、Bcl-xL、Survivin等细胞增殖、凋亡相关蛋白的表达，从而促进肿瘤细胞凋亡。另一篇针对前列腺癌的研究[12]显示，番茄碱可有效抑制PC-3细胞增殖，诱导其凋亡，且呈浓度依赖性。本研究主要观察了番茄碱对胃癌BGC-823细胞线粒体凋亡通路相关蛋白Bcl-2、Bax蛋白表达的影响。Bcl-2作为Bcl-2家族抗凋亡蛋白的重要成员，其过表达与多种恶性肿瘤的发生、发展有关[14]。而Bax可形成同源二聚体，破坏线粒体膜的完整性，发挥促进细胞凋亡的作用。本研究中，与对照组比较，不同浓度番茄碱均可显著上调Bax表达，下调Bcl-2表达，从而促进胃癌细胞发生凋亡,且随其浓度的增高，促凋亡作用逐渐增强。由此推测，番茄碱可能通过线粒体凋亡途径，调节凋亡相关蛋白的表达，进而发挥诱导胃癌细胞凋亡的作用。

综上所述，番茄碱能够在体外抑制胃癌BGC-823细胞增殖并诱导其凋亡，这一过程可能通过Bcl-2/Bax相关的信号通路介导。其确切机制及体内实验是否有类似结果，有待进一步研究。

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新疆医科大学科研创新基金项目(XYDCX2014103)。

2017-05-11)