全反式维甲酸在成年小鼠神经干细胞分化中的调控作用及机制

李先红，胡鹤娟，唐曦瀛，吴坚，黄金忠，姚允怡,3

(1苏州大学附属常州第一人民医院，江苏常州213000；2苏州卫生职业技术学院；3徐州医科大学)

全反式维甲酸在成年小鼠神经干细胞分化中的调控作用及机制

李先红1，胡鹤娟2，唐曦瀛2，吴坚1，黄金忠1，姚允怡2,3

(1苏州大学附属常州第一人民医院，江苏常州213000；2苏州卫生职业技术学院；3徐州医科大学)

目的研究全反式维甲酸(ATRA)对成年小鼠神经干细胞(NSCs)的调控、信号通路及对细胞色素P450(CYP450)家族的影响。方法分离并培养成年小鼠脑室下区NSCs，将细胞分为ATRA组和对照组，ATRA组加入10-6mol/L ATRA，对照组正常培养。采用流式细胞仪检测两组细胞表面标记物，计算神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和NSCs占总细胞数的百分比；Real-time PCR方法检测CYP450家族相关基因表达情况，筛选出有统计学意义的基因；ELISA法测定细胞色素P450还原酶(CPR)的活性；Western blotting法检测P38 MAPK通路相关蛋白P38、p-P38蛋白的相对表达量。结果ATRA组NSCs主要是向神经元分化，也有一部分向星形胶质细胞分化，少突胶质细胞较少。与对照组比较，ATRA组P450家族基因中CYP26A1、CYP26B1、CYP26C1表达上调(P均<0.05)。ATRA组CPR活性以及p-P38蛋白表达量均较对照组升高(P均<0.05)。结论ATRA促进小鼠NSCs向神经元分化，可能通过上调CYP450中的CYP26家族基因、增加CPR活性以及P38 MAPK通路发挥调控作用。

全反式维甲酸；神经退行性疾病；神经干细胞；细胞色素P450；细胞色素P450还原酶；P38 MAPK通路

神经干细胞(NSCs)是具有分裂潜能和自我更新能力的神经母细胞，主要存在于中枢神经系统(CNS)中，可分化为神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞[1]。以NSCs取代损伤和变性的脑组织有望成为治疗阿尔兹海默病(AD)、帕金森病(PD)等神经退行性疾病的新的治疗方案。NSCs在应用研究领域需要解决的首要问题就是定向分化。已有研究证实，全反式维甲酸(ATRA)可以诱导包括肿瘤干细胞在内的干细胞[2]及乳腺癌细胞[3]在内的多种实体瘤肿瘤细胞分化和凋亡。但ATRA对于NSCs的作用目前尚不明确。P38丝裂原活化蛋白激酶(P38 MAPK)除参与多种肿瘤细胞的增殖、凋亡外，还参与多种干细胞的分化。细胞色素P450(CYP450)代谢酶系统与神经退行性疾病代谢、进展关系密切，在抑制CYP450还原酶(CPR)基因表达的小鼠模型中，可提高星形胶质细胞的增殖活性[4]。2016年1月～2017年5月，我们观察了ATRA对NSCs增殖、分化的影响，并观察其调控通路以及对CYP450代谢酶系统的调节作用。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性8周龄C57BL/6小鼠购自南京大学模式动物研究所。ATRA购自Sigma-Aldrich公司，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)和巢蛋白(nestin)购自Peprotech公司，B27/DMEM培养基和多聚左旋赖氨酸Poly-L-lysine hydrobromide购自GIBCO公司，代谢酶相关基因检测试剂盒购自QIAGEN公司，Western blotting检测相关试剂、小鼠CPR活性检测ELISA试剂盒购自中国碧云天公司。

1.2 NSCs的分离及培养 将小鼠用二氧化碳吸入法处死，显微镜下切下两侧脑室下区外侧壁。加入木瓜蛋白酶消化分离细胞30 min，加入无血清培养基终止消化，4 ℃离心10 min，弃上清液，PBS洗脱，计数细胞数量。加NSCs完全培养基(成分为B27/DMEM，含20 ng/mL bFGF、20 ng/mL EGF和1%体积分数的青霉素-链霉素),置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。7 d后传代，取生长良好的第3代NSCs备用。

1.3 ATRA最佳浓度筛选 将NSCs按1×104/孔接种于6孔板中，加入完全培养基，每2天更换1次培养基。分别加入0、10-8、10-7、10-6mol/L ATRA，培养7 d后通过倒置显微镜计算神经球数量，以加入ATRA各浓度后神经球数量与未加入ATRA时的神经球数量比值表示细胞增殖能力，以细胞增殖能力最低的10-6mol/L作为ATRA最佳浓度，进行后续实验。

1.4 细胞定向分化情况检测 取第3代NSCs接种于6孔板中，加入含1%体积分数的青霉素-链霉素的B27/DMEM培养基，将细胞分为ATRA组和对照组，ATRA组加入10-6mol/L ATRA，对照组不加药物。培养96 h后，采用流式细胞仪检测细胞表面标记物，分别以NSE阳性标记为神经元、GFAP阳性标记为星形胶质细胞、MBP阳性标记为少突胶质细胞、nestin阳性标记为NSCs。细胞百分数=鉴定的细胞数/总细胞数×100%。

1.5 CYP450家族基因检测 取第3代NSCs接种于6孔板中，加入含1%体积分数的青霉素-链霉素的B27/DMEM培养基，将细胞分为ATRA组和对照组，ATRA组加入10-6mol/L ATRA，对照组不加药物，分别处理6、12、24 h后提取RNA，反转录合成cDNA后用作模板，然后将cDNA与 RT2 SYBR Green MasterMix混合，再将混合物准确加入 RT2 Profiler PCR Array 的每一孔中，在Real-time PCR仪(ABI7500)上检测药物Ⅰ相代谢酶相关基因。本实验仅观察CYP450家族基因，筛选出两组有统计学差异的基因，其他基因暂不研究。

1.6 CPR活性测定 取第3代NSCs，培养于含B27/DMEM、1%体积分数的青霉素-链霉素的6孔板中。将细胞分为ATRA组和对照组，ATRA组加入10-6mol/L ATRA，对照组不加药物。培养48 h后，采用超速离心方式收集微粒体，采用ELISA试剂盒检测CPR活性。用酶标仪在450 nm波长处测OD值，计算CPR活性。

1.7 P38 MAPK通路相关蛋白检测 采用Western blotting法检测P38 MAPK通路相关蛋白p-P38、P38表达。取第3代NSCs，培养在含B27/DMEM、1%体积分数的青霉素-链霉素的6孔板中。将细胞分为ATRA组和对照组，ATRA组加入10-6mol/L ATRA，对照组不加药物。培养48 h后收集细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取适量蛋白提取液进行SDS-PAGE电泳，电转移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉室温封闭后，分别加入一抗、P38(1∶800)、p-P38(1∶800)孵育过夜，以GAPDH为内参。ECL化学发光试剂显色，Image J图像分析系统测定各条带灰度值，以目的条带与内参条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 两组NSCs分化情况比较 对照组nestin阳性细胞占53.11%±6.60%，GFAP阳性细胞占29.89%±5.39%，NSE阳性细胞占11.75%±3.96%，MBP阳性细胞占5.24%±0.85%。ATRA组nestin阳性细胞占34.68%±6.61%，GFAP阳性细胞占35.08%±4.86%，NSE阳性细胞占23.65%±3.16%，MBP阳性细胞占6.59%±0.79%。ATRA组神经元比例高于对照组，NSCs比例低于对照组(P均<0.05)。

2.2 两组CYP450家族基因表达比较 与对照组比较，ATRA组P450家族基因中CYP26A1、CYP26B1、CYP26C1的表达上调(P均<0.05)。见表1。

表1 两组CYP450家族基因表达情况比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

2.3 两组CPR活性比较 ATRA组CPR活性的OD值为29.85±3.94，对照组为20.88±3.21，ATRA组CPR活性较对照组升高(P<0.05)。

2.4 两组p-P38、P38蛋白表达比较 ATRA组P38表达与对照组比较无统计学差异，p-P38表达高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组P38、p-P38蛋白的相对表达量比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

20世纪90年代，Reynodls等[5]首先提出了NSCs的概念。其在成年小鼠脑纹状体中分离出具有向多元化分化，在体外无限制分裂增殖的细胞群，具有这些特征的细胞被称为NSCs。NSCs定向分化是目前干细胞应用的研究热点。NSCs定向分化既受到干细胞自身基因的调控，也受外来信号和外部微环境的调控。ATRA是常见的诱导分化的化合物，可以与维甲酸受体RARα、RARβ(前脑、中脑、后脑和脊神经节)及RARγ(脑垂体和纹状体)结合形成复合物并调控相关基因的表达，从而维持神经细胞生长分化[6, 7]。维甲酸受体在神经细胞中分布广泛，为ATRA参与NSCs分化提供解剖基础，使其有望成为神经元损伤及包括AD、PD等退行性病变治疗的有效药物。但目前ATRA的神经诱导分化作用尚不清楚。

神经元是所有神经系统疾病的功能细胞，参与所有信息的感知、传递、整合和神经冲动的执行，是临床应用于神经退行性疾病治疗的新的热点[8]。神经元坏死或病变是很多神经退行性疾病的病理基础。近年研究发现，提高大脑内神经元数量是改善、缓解甚至治疗AD和PD的方法之一，移植NSCs并促使其向神经元分化，是AD、PD的潜在治疗方案。在PD中，NSCs移植治疗已经取得了部分成功[9，10]。星形胶质细胞是哺乳动物脑内分布最广泛的一类细胞，其功能包括支持屏障作用、营养性作用、修复和再生作用、维持神经元周围的K+平衡[11]。星形胶质细胞对神经系统严重损伤、脑缺血预后及生存率有明显的保护作用，可能会成为阿尔兹海默病潜在的治疗方案[12]。本研究发现，对照组NSCs占53.11%±6.60%，星形胶质细胞占29.89%±5.39%，神经元占11.75%±3.96%；而ATRA组NSCs占34.68%±6.61%，星形胶质细胞占35.08%±4.86%，神经元占23.65%±3.16%。ATRA组神经元比例高于对照组，表明在正常情况下，NSCs主要向星形胶质细胞分化，而加入10-6mol/L ATRA可以诱导NSCs向神经元分化，为未来NSCs的移植提供了可能。

CYP450为一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白的超家族，它参与体内绝大多数内源性、外源性物质(药物、环境化合物)的代谢。在真核细胞中，CYP450主要分布在内质网和线粒体内膜上，是药物代谢过程中的关键酶。NADPH-CPR是一种微粒体黄素蛋白，它特异性地参与了所有微粒体中CYP450的氧化还原反应，负责将电子从NADPH传递到P450，因此CPR参与调控类固醇合成的CYP450，影响药物代谢。CYP26家族由CYP26A1、CYP26B1、CYP26C1三种酶组成，是ATRA代谢酶之一，当ATRA达到一定阈值浓度，能够影响生殖细胞的分化方向(形成精原细胞或卵原细胞)[13]。Gocek等[14]研究证实，急性髓性白血病细胞系可通过ATRA影响粒细胞样细胞分化，CPR还可增强ATRA诱导急性髓性白血病细胞中的mRNA和蛋白表达水平。本研究表明，在ATRA作用于成年小鼠NSCs的药物代谢中，相比其他P450家族基因，CYP26A1、CYP26B1和CYP26C1的表达显著上调，与CYP26家族基因表达变化一致的是CPR活性显著增强，提示CYP26家族、CPR可通过参与ATRA代谢，可促进NSCs向神经元方向分化，也为我们提供了一种通过影响CPR活性从而改变NSCs分化方向的可能。

P38是MAPK家族控制炎症反应最重要的成员，在不同的刺激下激活，如外源性的脂多糖、紫外线以及不同的应激反应，从而在炎症、细胞应激、凋亡、细胞周期和细胞生长等过程中起重要作用[15]。除此之外，P38 MAPK还参与了干细胞分化过程。P38 MAPK通路激活可促进成骨细胞分化[16]、牙髓干细胞向成牙本质细胞方向分化[17]、促进MSC分化为表皮细胞[18]。本研究通过Western blotting方法观察ATRA对NSCs的作用，发现P38表达未见显著差异，而p-P38表达则显著增强，提示ATRA可能通过P38 MAPK通路参与NSCs的分化。

综上所述，ATRA能够抑制成年小鼠NSCs增殖，促进其向神经元和星形胶质细胞分化。在此调控过程中，细胞色素P450 CYP26家族和CPR发挥重要的代谢作用，其调控可能通过P38 MAPK通路进行。

[1] Mckay R. Stem cells in the central nervous system[J]. Science, 1997,276(5309):66-71.

[2] Haque A, Banik NL, Ray SK. Emerging role of combination of all-trans retinoic acid and interferon-gamma as chemoimmunotherapy in the management of human glioblastoma[J]. Neurochem Res, 2007,32(12):2203-2209.

[3] Mangiarotti R, Danova M, Alberici R, et al. All-trans retinoic acid (ATRA)-induced apoptosis is preceded by G1 arrest in human MCF-7 breast cancer cells[J]. Br J Cancer, 1998,77(2):186-191.

[4] Yao Y, Liu S, Wang Y, et al. Suppression of cytochrome P450 reductase expression promotes astrocytosis in subventricular zone of adult mice[J]. Neurosci Lett, 2013,548:84-89.

[5] Reynolds BA, Weiss S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system[J]. Science, 1992,255(5052):1707-1710.

[6] Wagner E, Luo T, Drager UC. Retinoic acid synthesis in the postnatal mouse brain marks distinct developmental stages and functional systems[J]. Cereb Cortex, 2002,12(12):1244-1253.

[7] Jacobs S, Lie DC, Decicco KL, et al. Retinoic acid is required early during adult neurogenesis in the dentate gyrus[J]. Proc Nati Acad Sci U S A, 2006,103(10):3902-3907.

[8] Pastukhov YF, Plaksina DV, Lapshina KV, et al. Exogenous protein HSP70 blocks neurodegeneration in the rat model of the clinical stage of Parkinson's disease [J]. Dokl Biol Sciences, 2014,457(1):225-227.

[9] Kefalopoulou Z, Politiis M, Piccini P, et al. Long-term clinical outcome of fetal cell transplantation for Parkinson disease: two case reports[J]. JAMA Neurol, 2014,71(1):83-87.

[10] Yoon HH, Min J, Shin N, et al. Are human dental papilla-derived stem cell and human brain-derived neural stem cell transplantations suitable for treatment of Parkinson′s disease[J]. Neural Regen Res, 2013,8(13):1190-1200.

[11] 刘慧,王小军,胡荣,等.星形胶质细胞[J].生理科学进展,2004,35(1):86-91.

[12] Lee IS, Jung K, Kim IS, et al. Human neural stem cells alleviate Alzheimer-like pathology in a mouse model[J]. Mol Neurodegener, 2015,10:38.

[13] 韩飞,刘智皓,吴风瑞,等.维甲酸和Cyp26基因家族与生殖细胞分化[J].细胞生物学杂志,2009,31(03):355-360.

[14] Gocek E, Marchwicka A, Bujko K, et al. NADPH-cytochrome P450 reductase is regulated by all-trans retinoic acid and by 1,25-dihydroxyvitamin D3 in human acute myeloid leukemia cells[J]. PLoS One, 2014,9(3):e91752.

[15] Ono K, Han J. The p38 signal transduction pathway: activation and function[J]. Cell Signal, 2000,12(1):1-13.

[16] Rey A, Manen D, Rizzoli R, et al. Evidences for a role of p38 MAP kinase in the stimulation of alkaline phosphatase and matrix mineralization induced by parathyroid hormone in osteoblastic cells[J]. Bone, 2007,41(1):59-67.

[17] Qin W, Lin ZM, Deng R, et al. p38a MAPK is involved in BMP-2-induced odontoblastic differentiation of human dental pulp cells[J]. Int endod J, 2012,45(3):224-233.

[18] 朱国俊,白晓东,付小兵,等.大鼠骨髓间充质干细胞诱导分化为表皮细胞的实验观察[J].感染、炎症、修复,2004,5(4):140-142.

Regulationofall-trans-retinoicacidondifferentiationofneuralstemcellsinadultmice

LI Xianhong1, HU Hejuan, TANG Xiying, WU Jian, HUANG Jinzhong, YAO Yunyi

(1 The First People's Hospital of Changzhou Affiliated to Soochow University, Changzhou 213000, China)

ObjectiveTo investigate the effects of all-trans-retinoic acid (ATRA) on signaling pathway and regulations of neural stem cells (NSCs) in adult mice and the effects on the family of cytochrome P450 (CYP450).MethodsNSCs were isolated from the sub-ventricular zone (SVZ) of brain in adult mice and then were cultured. The cells were divided into the ATRA group and blank control group. The ATRA group was added with 10-6mol/L ATRA. Flow cytometry (FCM) was used to detect the cell surface markers in the two groups, and we calculated the percentage of neurons, astrocytes, oligodendrocytes and the percentage of NSCs accounting for total cells. The real-time PCR was used to detect the related gene expression of CYP450 family, and we screened statistically significant gene. ELISA was applied to detect the activity of cytochrome P450 reductase (CPR). The expression levels of P38 and p-P38 were detected by using Western blotting.ResultsIn the ATRA group, NSCs mainly differentiated into neurons, and some differentiated into astrocytes, with less differentiation of oligodendrocytes. Compared with the blank control group, the expression of CYP26A1, CYP26B1 and CYP26C1 in the P450 family genes of the ATRA group was up-regulated (allP<0.05). The activity of CPR and the expression of p-P38 protein in the ATRA group were higher than those in the blank control group (bothP<0.05).ConclusionATRA promotes the differentiation of mouse NSCs into neurons, and it may play a regulatory role by up-regulating the CYP26 family genes in CYP450 and increasing CPR activity and the P38 MAPK pathway.

all-trans-retinoic acid; neurodegeneration; neural stem cells; cytochrome P450; cytochrome P450 reductase; P38 MAPK pathway

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.42.003

R741

A

1002-266X(2017)42-0009-04

江苏省自然科学基金资助项目(BK20130219)；江苏高校“青蓝工程”科研资助项目。

李先红(1990-)，女，硕士在读，主要研究方向为神经变性性疾病。E-mail: tiancheng503@126.com

黄金忠(1973-)，男，博士，硕导，主要研究方向为神经变性性疾病。E-mail: jshjz@163.com；

姚允怡(1981-)，男，博士，主要研究方向为神经生物学和药物代谢调控。E-mail: yaoyunyiyyy@126.com

2017-06-25)