姜黄素通过Erk1/2信号通路抑制人肾癌细胞786-O在裸鼠体内增殖

赵建通,张磊,刘文瞻,徐飞,郭明涛,路志民,肖波

(1.邯郸市第一医院 泌尿一科,河北 邯郸 056000;2.河北医科大学 基础医学院,河北 石家庄050012)

姜黄素通过Erk1/2信号通路抑制人肾癌细胞786-O在裸鼠体内增殖

赵建通1,张磊2,刘文瞻1,徐飞1,郭明涛1,路志民1,肖波1

(1.邯郸市第一医院 泌尿一科,河北 邯郸 056000;2.河北医科大学 基础医学院,河北 石家庄050012)

目的:探讨姜黄素对786-O细胞在体内增殖的抑制效果及其可能机制.方法:将人肾癌细胞786-O接种裸鼠,成瘤后将裸鼠随机分为2组,干预组给予姜黄素干预治疗,对照组则采用PBS对照治疗.测定干预组肿瘤的抑制率,并采用Western blot和免疫组织化学方法检测p-Erk1/2和p-Akt表达.结果:经过连续20 d给药治疗,干预组裸鼠的瘤体平均质量为(1.03±0.17)g,对照组裸鼠的瘤体平均质量为(2.46±0.48)g,2组差异有统计学意义(P=0.02).采用姜黄素干预后小鼠的肿瘤抑制率达58.13%.Western blot及免疫组织化学染色结果均证实干预组裸鼠瘤内Erk1/2的磷酸化水平显著低于对照组(P<0.01),而2组Erk1/2、Akt及p-Akt表达水平差异无统计学意义(P>0.05).结论:姜黄素具有较好的抑制肿瘤生长的效果,通过抑制Erk1/2的磷酸化,进而抑制人肾癌细胞786-O在裸鼠体内增殖.

姜黄素;人肾癌细胞;Erk1/2;Akt;体内

姜黄素(curcumin)是一种天然的酚性化合物[1],市售的姜黄素大多是从姜科姜黄属中草药植物中提取的,如姜黄、莪术、郁金和石菖蒲等[2].姜黄素的临床药理学作用较为广泛,包括抗炎[3]、抗病毒[4]、抗动脉粥样硬化[5]、抗氧化[6]等.近些年来越来越多报道表明姜黄素具有较好的抗肿瘤效果[7],研究证实姜黄素可以抑制结肠癌[8]、肺癌[9]及胰腺癌[10]等肿瘤细胞的增殖. 但在肾癌方面的报道较为少见,本课题组前期研究已证实姜黄素对于人肾癌细胞786-O的体外抑制作用[11],为进一步探索姜黄素在体内的肿瘤抑制效果,本研究通过裸鼠皮下种植人肾癌细胞786-O,姜黄素连续治疗后评估肿瘤抑制率,并进一步探讨其作用机制.

1 材料和方法

1.1 材料 人肾癌细胞786-O购自中国科学院上海细胞研究所,姜黄素购自成都思科华生物技术有限公司,SPF级BALB/c裸鼠购自南方医科大学实验动物中心(动物许可证号:44002100011653),1640细胞培养基及FBS均购自美国HyClone公司,磷酸化的Erk1/2(p-Erk1/2)单克隆抗体及GAPDH内参抗体购自美国CST公司,HRP标记羊抗鼠二抗购自杭州弗德生物制药有限公司,组织蛋白提取试剂盒购自北京康润生物科技有限公司,其他常规试剂均为国产分析纯.

1.2 方法

1.2.1 裸鼠成瘤及姜黄素干预:裸鼠接种786-O细胞前2 h,采用胰酶消化培养的细胞,计数后将其稀释至5X106个/200 μL,每只裸鼠颈背部皮下注射200 μL细胞悬液,接种7 d左右可以观察到裸鼠背部明显成瘤,在接种肿瘤细胞后第8天将10只裸鼠随机分成2组,干预组裸鼠腹腔注射50 mg/kg姜黄素进行治疗,对照组裸鼠则注射等剂量的PBS.

1.2.2 肿瘤抑制率测定:在连续治疗20 d后处死裸鼠,剥离皮下肿瘤进行称重,计数肿瘤的抑制率,抑制率计算方法为:(1-干预组裸鼠肿瘤平均重量/对照组肿瘤平均重量)X100%.

1.2.3 Western blot分析:采用试剂盒提取组织总蛋白,测定样品蛋白浓度后,每个加样孔上样60 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳,湿转至PVDF膜后,采用5%脱脂奶37 ℃封闭2 h,PBST稀释一抗,4 ℃孵育一抗过夜,PBST洗涤后,孵育HRP标记的山羊抗小鼠二抗,之后进行压片.

1.2.4 免疫组织化学分析:对肿瘤组织进行石蜡包埋后切片,分别采用二甲苯和无水乙醇脱石蜡和脱水,在枸橼酸钠溶液煮沸10 min介导抗原复性.之后分别采用3%过氧化氢和1%胎牛血清白蛋白封闭内源性过氧化物酶活性和非特异性位点,采用PBS稀释的一抗孵育,4 ℃过夜.PBST洗涤后加入HRP标记的二抗,每步均室温孵育20 min,加入发光液后显色.

1.3 统计学处理方法 采用SPSS20.0软件进行统计学处理.计量资料采用表示,干预组与对照组小鼠肿瘤重量及蛋白表达量均采用Student's t检验进行分析.P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 姜黄素抑制肿瘤生长 在连续给药20 d后处死裸鼠,剥离皮下肿瘤后进行称重,见图1.姜黄素干预组裸鼠的瘤体平均质量为(1.03±0.17)g,对照组裸鼠的瘤体平均质量为(2.46±0.48)g,2组差异有统计学意义(P=0.02).采用姜黄素干预后小鼠的肿瘤抑制率达58.13%.

图1 2组小鼠成瘤情况

2.2 Western blot检测结果 与对照组比,干预组裸鼠肿瘤组织p-Erk1/2蛋白相对表达量显著下降,差异有统计学意义(P<0.01);Erk1/2、Akt及p-Akt蛋白相对表达量变化差异无统计学意义(P>0.05),见图2.

2.3 免疫组织化学法检测结果 对组织进行免疫组织化学染色后,进行拍照,对各组图片进行染色强度分析,每组选择6张图片,取平均值进行比较,结果表明p-Akt染色强度在对照组与干预组间差异无统计学意义(P>0.05),而干预组p-Erk1/2的表达量显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),见图3.

3 讨论

肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是临床上最常见的肿瘤性疾病之一,在所有成年人恶性肿瘤中占2%~3%[12].在美国每年约有3万RCC新增病例[13].肾透明细胞癌(renal clear cell carcinoma,RCCC)是RCC最常见的亚型之一,占RCC患者总数的80%~90%[14].研究证实多种环境及遗传因素与RCC的发生发展密切相关[15],但导致RCC原癌基因激活及肿瘤发展的分子机制仍有待研究.

图2 Western blot检测2组裸鼠肿瘤组织Erk1/2、Akt磷酸化情况

图3 免疫组织化学法检测2组裸鼠肿瘤组织p-Erk1/2、p-Akt表达(X400)

RCC常规治疗方法包括化疗、放疗及激素疗法,均会产生耐受.姜黄素是一种天然存在的抗肿瘤化合物,本课题组前期研究证实姜黄素在体外可以抑制肾癌细胞786-O的生存和增殖,并诱导肿瘤细胞凋亡[11].ZHANG等[16]研究也证实姜黄素可以调节Bcl-2及Bax表达,诱导细胞G2/M期阻滞,进而显著诱导细胞凋亡.本研究在此基础上对姜黄素的体内抗肿瘤效果进行了评估,并初步探讨了其作用机制,结果表明,通过腹腔注射50 mg/kg姜黄素连续治疗20 d,裸鼠的肿瘤生长得到抑制,肿瘤的抑制率为58.13%.Western blot检测Erk1/2及Akt信号通路蛋白结果表明,姜黄素通过抑制Erk1/2的磷酸化而非Akt的磷酸化从而抑制肿瘤细胞在体内的增殖,免疫组织化学结果也进一步证实了这一结果.ZHANG等[16]的研究表明,Akt信号通路参与了姜黄素抑制肾细胞癌RCC-949的增殖,这与本研究结果不一致,出现这一情况的原因可能是RCC的发生机制较多,且采用不同的细胞系进行研究也可能是导致结果不一致的主要原因.

综上所述,姜黄素具有较好的抑制肿瘤生长的效果,通过抑制Erk1/2的磷酸化,进而抑制人肾癌细胞786-O在裸鼠体内增殖.

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(本文编辑:赵翠翠)

Curcumin inhibits the proliferation of human renal cell carcinoma 786-O in nude mice via Erk1/2 signaling pathway

ZHAO Jiantong1, ZHANG Lei2, LIU Wenzhan1, XU Fei1, GUO Mingtao1, LU Zhimin1, XIAO Bo1.
1.Department of Urology, Handan First People's Hospital, Handan, 056000; 2.Institute of Foundation, Hebei Medical University, Shijiazhuang, 050012

Objective:To investigate the inhibitory effect of curcumin on 786-O cells and explore the potential mechanisms.Methods:Nude mice were randomly divided into two groups. Human kidney cancer cells 786-O were inoculated in nude mice. Intervention group mice were treated with curcumin and the control group mice were treated with PBS. The inhibition rate of tumor in the intervention group was determined. p-Erk1/2 and p-Akt expression was detected using Western blot and immunohistochemistry.Results:The average weight of the tumor of nude mice was (1.03±0.17)g in the intervention group and (2.46±0.48)g in the control group, the difference was significant (P=0.02). The tumor inhibition rate of mice treated with curcumin was 58.13%. Western blot and immunohistochemical staining showed that the phosphorylation level of Erk1/2 in intervention group was significantly lower than that in the control group (P<0.01), no significantly difference was observed in the expression of Erk1/2, Akt and p-Akt in the two groups (P>0.05).Conclusion:The results of this study show that curcumin can inhibit the growth of tumor in vivo and inhibit the phosphorylation of Erk1/2 and inhibit the proliferation of human renal carcinoma cell line 786-O in nude mice.

curcumin; human renal carcinoma cell; Erk1/2; Akt; in vivo

R285.5;R692.9

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.10.007

2017-04-18

邯郸市科技计划项目(1423108063-10).

赵建通(1980-),男,河北邢台人,主治医师,硕士.

肖波,主任医生,Email:819543118@qq.com.