凯氏定氮法测定胶原蛋白海绵中蛋白质含量的不确定度评定

北京市医疗器械检验所（101111）吴晓丽 刘曦

测量不确定度的定义为表征合理地赋予被测量之值的分散性，与测量结果相关联的参数。在理化检测中，对各类影响因素进行分析，评定其不确定度，不仅能帮助检测人员确定检测结果的可信程度，确保检测结果的准确可靠，还能有助于识别出测定过程的关键环节，重点关注关键环节的质量控制，有效提高检测工作的质量[1]。因此对测定方法进行不确定度评估是必要的。

胶原蛋白的特殊组织结构赋予其良好的止血及促进伤口愈合及组织修复功能，并具有高生物可降解性、高生物可吸收性、低抗原性等功能，这使其在医药卫生领域具有良好及广泛的应用前景，广泛应用于止血、创面愈合、骨缺损、神经修复等方面，被视为在科研和临床应用中最有用途的生物材料之一[2][3]。

附表1 蛋白质含量重复性测定数据

本文以国家计量规范及相关文献作为理论和方法指导[4-8]，对凯氏定氮法测定胶原蛋白海绵中蛋白质含量的不确定度进行了评估，最终得出检测结果的扩展不确定度值。

1 原理

参考《中华人民共和国药典》2015版四部通则蛋白质含量测定法第一法凯氏定氮法[9]中钨酸沉淀法对胶原蛋白海绵中蛋白质含量进行测定。通过测定供试品的总氮含量以及经钨酸沉淀去除蛋白质的供试品滤液中的非蛋白质氮含量，计算出蛋白质的含量。

2 仪器与试剂

硫酸标准滴定溶液（0.100mol/L）,容量瓶（100mL），滴定管（25mL、分度0.1mL），吸管（2mL、5mL、10mL和25mL），分析天平（0.01mg），定氮蒸馏装置，硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠、浓硫酸、硼酸、钨酸钠：均为分析纯。试验用水：Milli-Q纯水机制备的超纯水。

3 试验过程

3.1 测定总氮含量样品的消化 精密称取样品m1（精确至0.0001g），置凯氏定氮瓶中，加入0.3g硫酸铜、3g硫酸钾和20mL硫酸消化至澄明，呈蓝绿色，继续消化1h，转移至100mL容量瓶中，用超纯水定容。

3.2 测定非蛋白氮含量样品的消化 精密称取样品m2，加水14mL、10%钨酸钠溶液2mL、0.33mol/L硫酸溶液2mL，摇匀，静置30分钟过滤，取滤液5mL，置凯氏定氮瓶中，加入0.3g硫酸铜、3g硫酸钾和20mL硫酸消化至澄明，呈蓝绿色，继续消化1h，转移至100mL容量瓶中，用超纯水定容。

3.3 测定 准确吸取10mL用于总氮含量测定的样品试液加入定氮蒸馏装置中进行蒸馏，接收液用0.005mol/L硫酸滴定液进行滴定至溶液颜色为灰紫，记录所消耗的硫酸滴定液体积v1（mL）。将用于非蛋白氮含量测定的样品试液移入定氮蒸馏装置中，重复以上蒸馏、滴定步骤，记录所消耗的硫酸滴定液体积v2（mL）。将空白对照溶液移入定氮管内，重复以上蒸馏、滴定步骤，用空白试验进行校正，记录所消耗的硫酸滴定液体积v0（mL）。

4 建立数学模型

式中：x—样品中蛋白质含量，%；v1—样品总氮含量测定溶液消耗的硫酸滴定液体积，mL；v2—样品非蛋白氮含量测定溶液消耗的硫酸滴定液体积，mL；v0—空白对照溶液消耗的硫酸滴定液体积，mL；C—硫酸滴定液浓度（C(1/2H2SO4)），mol/L；n1—用于总氮含量测定的样品稀释倍数；n2—用于非蛋白氮含量测定的样品稀释倍数；m1—用于总氮含量测定的样品质量，mg；m2—用于非蛋白氮含量测定的样品质量，mg；14.01—氮的相对原子质量；F—5.55，换算系数（1g氮相当于5.55g蛋白质）。

5 不确定度的来源与量化

式中：urel(x)—胶原海绵中蛋白质含量的相对不确定度；urel(f)—样品重复性测定产生的相对不确定度；urel(A)—测定样品与空白时所用器具产生的相对不确定度；urel(c)—硫酸标准滴定溶液产生的相对不确定度；urel(m)—天平称量产生的相对不确定度。

6 不确定度分量的评定

6.2.2 移液管引入的不确定度UrelV)测定样品与空白时用到2mL移液管、5mL移液管、10mL移液管和25mL分度吸管，按均匀分布，各个移液管的相对标准不确定度见附表2。

附表2 移液管的不确定度

7 扩展不确定度分析

8 结论

由评定结果可以看出，胶原海绵中蛋白质含量测量结果的不确定度主要来自于样品的称量、移取、稀释和重复性测定，其他部分的不确定度已随机化，对测量结果的不确定度影响很小，均放在测量重复性不确定度中考虑。在实际工作中，应对影响测量结果的各种主要因素严格控制，以减少测量结果的不确定度，提高测量结果的可信度。样品的称量、移取、稀释和重复性测定是凯氏定氮法测定胶原蛋白海绵中蛋白质含量不确定度的主要因素，在试验中使用的玻璃仪器均为A级，不能通过提高器具的精密度改善结果，但可以通过下列措施对上述不确定度主要因素进行优化，可使测定结果更加可靠。①使用自动化凯氏定氮仪器对样品进行消化和滴定，将有效控制试验过程中产生的随机误差，降低由试验重复性引起的不确定度。②在试验方法允许的前提下，通过优化样品的取样量和滴定管的体积，降低天平称量产生的相对不确定度Urel(m)和滴定管引入的相对不确定度Urel(B)，从而降低本方法的不确定度。