吉林省耐多药结核分枝杆菌异烟肼耐药基因KatG突变特征分析

杨修军 张炜煜 张立夫 李可维



·短篇论著·

吉林省耐多药结核分枝杆菌异烟肼耐药基因KatG突变特征分析

杨修军 张炜煜 张立夫 李可维

采用DNA测序技术对吉林省287株耐多药结核分枝杆菌进行KatG基因序列检测，以H37Rv标准株KatG基因DNA序列为参比序列，分析检测菌株KatG基因突变特征。结果显示，239株耐多药结核分枝杆菌KatG基因发生突变，突变率为83.28%(239/287)；共涉及13个突变位点，最常见点突变位点为KatG315，突变率为58.18%(167/287)。

分枝杆菌，结核； 抗药性，多种，细菌； 异烟肼； 多态性，单核苷酸

异烟肼(INH)是结核病治疗中最主要的一线药物，同利福平(RFP)、吡嗪酰胺(PZA)、链霉素(Sm)一样是现代结核病控制策略短期化疗的基础药物[1]。KatG基因的突变、部分缺失是INH耐药的重要机制之一，该基因的完全缺失使得过氧化氢酶-过氧化物酶完全失活，从而导致对INH的高度耐药。KatG基因是结核分枝杆菌中过氧化氢酶-过氧化物酶的编码基因，该基因全长为2222个核苷酸。本研究旨在探讨吉林省耐多药结核分枝杆菌临床分离株INH耐药相关基因KatG基因的突变特征。

材料和方法

1.菌株来源：本实验所涉及370株结核分枝杆菌菌株，包括耐多药菌株287株、INH敏感菌株82株和H37Rv标准菌株1株，均由吉林省疾病预防控制中心结核参比实验室传代、培养、保存。287株耐多药菌株来源于吉林省4个结核病耐药监测地区，收集自2013年9月至2015年6月期间，药物敏感性试验(简称“药敏试验”)鉴定为RFP和INH同时耐药。结核分枝杆菌标准菌株H37Rv(ATCC27294)为质控菌株，由中国疾病预防控制中心馈赠，吉林省疾病预防控制中心结核参比实验室进行传代保藏。

2.药敏试验：采用比例法进行药敏试验[2]，包括INH、RFP、卡那霉素(Km)、氧氟沙星(Ofx)，培养基统一购自珠海贝索公司，且在有效期内使用。含药培养基内药物终浓度分别为INH 0.2 μg/ml、RFP 40.0 μg/ml、Ofx 2.0 μg/ml和Km 30.0 μg/ml。

3.细菌基因组DNA的提取：刮取罗氏培养基上的克隆菌1标准环，加入到200 μl TE缓冲溶液[三羟甲基氨基甲烷(Tris)-乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液](10 mmol/L Tris-HCL，1 mmol/L EDTA，pH 8.0)的EP(Eppendorf)离心管中，85 ℃金属浴30 min灭活，然后100 ℃金属浴10 min，13 400×g离心10 min，取上清液转移至新管中即为DNA模板，-20 ℃保存待用。

4.引物设计：根据GenBank记载的H37Rv菌株katG基因序列(Gene ID： 885638，NC_000968.3)，利用Primer Premier 5.0软件设计引物，扩增产物片段731 bp(扩增区域为结核分枝杆菌全基因组)，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。序列为：上游引物：5′-GATCGTCGGCGGTCACACTT-3′；下游引物：5′-CGTTGACCTCCCACCC-GACT-3′。

5. PCR扩增及序列测定：采用50 μl PCR反应体系，包括DNA模板2 μl，Gene Star预混PCR反应液 20 μl，引物(10 μmol/L)各2 μl，DEPC水(经焦碳酸二乙酯处理高温灭菌的纯水，不含DNA、RNA和蛋白质)24 μl。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经过Qiagen全自动电泳仪检测后，目的基因片段阳性产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

6.DNA序列分析：应用Mega 6.06软件将测序数据与H37Rv的KatG序列进行比对分析。

结 果

1. PCR扩增结果：1株H37Rv菌株和82株INH敏感菌株均扩增到KatG基因；287株耐多药菌株中270株扩增到KatG基因，检出率为94.08%(270/287)，17株耐多药菌株未检测到KatG基因扩增产物，KatG完全缺失率为 5.92%(17/287)。

2.产物测序和比对分析：将270株耐多药菌株、82株INH敏感菌株的KatG基因测序结果采用基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST)进行分析。

3.KatG基因多态性分析：H37Rv标准菌株KatG基因测序数据与参比序列比对结果一致。82株INH敏感菌株KatG基因测序数据与参比序列比对，有16株发生KatG基因第463位点突变，突变形式为精氨酸(Arg)→亮氨酸(Leu)，即CGG→CTG，突变率为 19.51%(16/82)。270株耐多药菌株KatG基因测序数据与参比序列比对，共涉及13个突变位点，21种突变类型，包含3种同义突变。KatG基因总突变率为83.28%(239/287)；KatG基因第315位点突变率为58.18%(167/287)，突变以丝氨酸(Ser)→苏氨酸(Thy)，即AGC→ACC为主，占50.52%(145/287)。另外，178株发生ArgKatG463Leu突变，其中56株仅发生KatG基因第463位点突变，突变率为19.51%(56/287)。具体见表1。

讨 论

INH为一种药物前体，在KatG基因编码的过氧化氢酶-过氧化物酶作用下，生成异烟酸，作用于结核分枝杆菌代谢的各个环节，尤其是抑制分枝菌酸的合成。有研究发现，90.7%的耐INH菌株存在KatG基因突变或缺失，特别是KatG基因第315位点发生率高且与耐药程度密切相关[3]。本研究中，KatG基因突变率为83.28%；KatG完全缺失率为5.92%，与现有报道一致[4-5]。采用测序手段检测发现，约有10%～20%耐INH菌株katG基因完全丢失，表明katG基因完全丢失可能是结核分枝杆菌耐药产生的机制之一[6]。

表1 270株耐多药结核分枝杆菌异烟肼耐药相关基因KatG 基因突变特征

研究表明，KatG基因315位点突变致使KatG基因活性位点甲基化，使得过氧化氢酶-过氧化物酶失去活化INH的能力。临床INH耐药菌株中的KatG基因的突变以KatG315Ser→Thr为主，发生率高达45%～75%[7-10]。耐多药菌株KatG基因第315位点突变率各地报道均不相同，俄罗斯地区突变率为93%[11]，南非地区突变率为97%[12]，中国东部地区报道的突变率为72.7%[13]。本研究中，吉林省耐多药菌株KatG基因第315位点突变率为58.18%，包括碱基突变、碱基缺失和位点联合突变等共计9种突变类型；其中KatG基因315位点突变以Ser→Thr(AGC→ACC)为主，其次为Ser→Asn、Ser→Arg、Ser→Gly，突变率为4.53%、1.05%、0.35%。本研究中INH耐药基因KatG基因突变除315位点突变外，还涉及12个位点突变，分别为第298、300、321、322、340、344、345、358、368、463、481、491位点，含有3个位点的同义突变，合计突变率为25.78%。

本研究显示，有16株INH敏感菌株发生KatG基因463位点突变，突变形式为Arg→Leu(CGG→CTG)，突变率为 19.51%；287株耐多药菌株中178株发生KatG基因463位点突变，56株仅为KatG基因第463位点单独突变。KatG基因463位点被认为是除了第315位点以外最常见的突变位点，国外学者通过动力学联合光谱学对含KatG463Leu和KatG463Arg两种蛋白的特性进行了研究，发现二者没有区别，而且这两种纯化蛋白在生物体内或氧化氢酶-过氧化物酶的参数未见差别，说明KatG基因第463位点密码子Arg→Leu 的突变与菌株INH耐药性没有关系[14]，只是一个和耐药无关的多态性位点。本研究中KatG基因扩增区域为全基因组，涵盖KatG基因第261、289、315、428、463等热点位点，研究中有31株耐多药菌株未检测到KatG基因突变，这些菌株可能存在其他的耐药位点或耐药机制，有待于进一步研究。

综上所述，吉林省耐多药结核分枝杆菌INH耐药相关基因KatG基因的高突变率和突变类型的多样性，提示通过检测KatG基因高突变位点可以更好地预测本省结核病中耐INH情况，为进一步建立耐多药菌株的快速检测方法提供理论和数据支持。

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(本文编辑：李敬文)

Mutation characteristics of theKatGgene of multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from Jilin province

YANGXiu-jun,ZHANGWei-yu,ZHANGLi-fu,LIKe-wei.

DepartmentofMicrobiologyTesting,JilinProvincialCenterforDiseaseControlandPrevention,Changchun130062,China

ZHANGWei-yu,Email: 81637146@qq.com

Mutations characteristics ofkatGgenes in 287 multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates from Jilin province were analyzed by DNA sequencing technique, H37Rv standard strain was selected as control. The results showed that mutation ofkatGgene occurred in 239 multi-drug-resistantMycobacteriumtuberculosis(83.28% (239/287)), involving 13 mutation sites. The most common mutation site wasKatG315 (58.18% (167/287)).

Mycobacteriumtuberculosis; Drug resistance, multiple, bacterial; Isoniazid; Polymorphism, single nucleotide

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.022

吉林省卫生计生委科研课题(2015ZC037)

130062 长春，吉林省疾病预防控制中心微生物检验所

张炜煜，Email：81637146@qq.com

2017-01-09)