MTB线粒体翻译控制28蛋白在昆虫细胞中的表达和纯化

卓文基 刘志辉 周琳 陈燕梅 陈涛 孙琦 郭卉欣



·技术交流·

MTB线粒体翻译控制28蛋白在昆虫细胞中的表达和纯化

卓文基 刘志辉 周琳 陈燕梅 陈涛 孙琦 郭卉欣

对MTB线粒体翻译控制(mitochondrial translation control，MTC) 蛋白MTC28基因进行克隆， 构建真核表达质粒并在昆虫细胞中表达MTC28蛋白。采用PCR技术从MTB H37Rv 标准株基因组中扩增MTC28基因片断，MTC28基因片断和质粒pFastbac1经EcoRI和XhoI双酶切，T4 DNH连接酶连接，构建重组质粒pFastbac1-MTC28，转染DH5α感受态细菌，在含有氨苄青霉素溶菌肉汤(lysogeny broth，LB)固体培养基中筛选阳性克隆，挑选生长的菌落进而在含有氨苄青霉素的液体LB培养基中进行细菌克隆。PCR鉴定目的基因插入质粒后，阳性克隆细菌进行质粒(pFastbac1-MTC28)的提取。pFastbac1-MTC28质粒转染DH10 Bac感受态细菌构建重组杆状质粒(Bacmid-MTC28)，用含有庆大霉素、卡那霉素和四环素的液体LB培养基进行细菌克隆，采取蓝白斑技术筛选阳性菌落。PCR鉴定为阳性的细菌进行杆状重组质粒(Bacmid-MTC28)的提取。利用脂质介导的转染技术，将杆状重组质粒(Bacmid-MTC28)转染sf9昆虫细胞中，包装重组杆状病毒，并表达蛋白质。结果成功构建了MTC28真核表达质粒，建立了杆状病毒表达MTC28蛋白的表达体系，并表达MTC28蛋白，通过纯化获得了高纯度且均一化的MTC28蛋白。

分枝杆菌, 结核； 线粒体蛋白质类； 基因, 线粒体； 转染； 质粒； 基因, 昆虫

当前全球面临的结核病疫情十分严峻，但现有结核病疫苗—卡介苗(BCG)免疫保护效果极不稳定，线粒体翻译控制(mitochondrial translation control，MTC：就是线粒体翻译控制)28 蛋白存在于MTB、牛分枝杆菌及少数的卡介菌中，该蛋白可被大多数结核病患者和感染者的血清所识别， 因此 MTC28是一种理想的疫苗候选抗原。本研究为了获得MTC28蛋白，克隆了MTC28基因，并成功首次构建到杆状病毒表达质粒穿梭载体杆粒(Bacmid)中并获得Bacmid-MTC28重组杆状病毒质粒。之后利用昆虫细胞表达体系，表达了MTC28蛋白，并进一步利用亲和层析(镍柱)和分子筛层析(Superdex 200 PG)纯化得到高纯度、均质化的MTC28蛋白。

材料和方法

一、材料

pFastbac1载体购自美国Invitrogen公司、大肠杆菌(Escherichiacoli)菌种DH5α为本实验室保存，菌种DH10 Bac购自美国Invitrogen公司。昆虫细胞系sf9、High Five购自美国Invitrogen公司；结核分枝杆菌H37Rv标准株(由本实验室保存)；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自德国TIANGEN公司)；限制性内切酶EcoRI、XhoI、T4 DNA连接酶、DNA marker(购自大连TaKaRa宝生物公司)；pfu DNA聚合酶(购自美国Promega公司)。亲和层析(镍柱)和分子筛(Superdex 200 PG)购自美国General Electric(GE)公司；AKTA Purifier仪器借用平台中心仪器。

二、 方法

(一)引物设计

参照美国基因数据库(Gen Bank)公布的序列(登录号：U7527.1)，扩增目的基因MTC28编码区长度为933 bp。上游引物MTC28-F：5′-CCGGAATTCATGATCCAGATCG-CGCGCAC-3′；下游引物1 MTC28-R1：5′-GCGCGGCGGGACTGGT-3′；下游引物2 MTC28-R2：5′-CCCTCGAGCTACATCATCACCATCACCAT(6×His-tag)GCGCGGCGGGACTGGT-3′。其中，CCG：上游引物保护性碱基；GAATTC：EcoRI内切酶位点；CG：下上物保护性碱基；CTCGAG：XhoI内切酶位点。

此外，合成M13引物进行杆状病毒重组质粒Bacmid-MTC28鉴定，上游引物M13-F：CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG；下游引物M13-R：AGCGGATAACAATTT-CACACAGG。上述所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司负责合成。

(二)目的基因的扩增

按曲拉通法(略有改进:根据MTB临床标本的特点，笔者对TE-Triton法中原有的裂解液进行了改进，改进后的配方为：三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(Tris-HCl) (pH 8.0)10 mmol, 乙二胺四乙酸(EDTA) 1 mmol, 聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100) 1%,chelex-100(一种聚苯乙烯基体离子交换树脂) 1%,乙基苯基聚乙二醇(NP-40) 10%。提取结核分枝杆菌H37Rv标准株的DNA，以此为模板扩增MTC28全长基因。PCR反应体系：超纯水24.25 μl，50%甘油5 μl，二甲基亚砜(DMSO) 2.5 μl，三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTPs) 4 μl，pfu缓冲液(pfu buffer)5 μl，上游引物MTC28-F 2 μl，下游引物MTC28-R1 2 μl，模板DNA 5 μl，pfu DNA聚合酶0.25 μl，总体积50 μl。PCR反应程序：94 ℃ 预变性5 min，进入循环，94 ℃变性55 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环；72 ℃终延伸10 min。产物经琼脂糖凝胶电泳后采用TIANGEN试剂盒纯化回收。

上述回收的片段用MTC28-F和MTC28-R2继续进一步PCR，以便连入6×His-tag标签，目的是便于后期表达的MTC28蛋白的纯化。

(三)真核表达载体的构建

碱裂解法提取质粒DNA，用EcoRI和XhoI双酶切真核表达载体pFastbac1(pFastbac1经过改造加入GP67分泌信号肽)和目的基因MTC28。上述双酶切产物分别进行琼脂糖凝胶电泳，电泳分离后的目的条带用TIANGEN试剂盒进行纯化回收，回收后的目的条带用T4 DNA连接酶连接，连接产物转染DH5α感受态细胞。

(四)真核表达载体的鉴定

经氨苄青霉素培养基筛选，挑取阳性菌落进行PCR鉴定。当菌液浑浊时，取1 μl菌液进行PCR鉴定，反应条件和反应程序同前。阳性菌液转接至4 ml玻璃管中进行摇菌，提取重组质粒pFastbac1-MTC28。

(五)昆虫表达载体的构建

将上述重组质粒pFastbac1-MTC28转化至DH10 Bac感受态细菌中，利用蓝白斑筛选技术进一步筛选阳性杆状重组穿梭载体杆粒(Bacmid-MTC28)。转染后的感受态细菌放置温箱中培养，待白斑明显后挑取白斑转接到4 ml含有卡那霉素、庆大霉素和四环素的溶菌肉汤(LB)液体培养基中进行细菌克隆。

(六)昆虫表达载体的鉴定和提取

用M13引物对上述菌液进行PCR测定，鉴定重组质粒Bacmid-MTC28。阳性条带大小为3300 bp，其中300 bp处为阴性条带。阳性菌液利用异丙醇沉淀法提取重组质粒Bacmid-MTC28。

(七)杆状病毒的制备

上述重组质粒Bacmid-MTC28转染对数生长期的草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda，Sf9)细胞，包装重组杆状病毒。在超净台中，胶原凝集素Ⅱ(CellfectinⅡ) 6～8 μl + unsupplemented Grace’s Medium 200 μl，轻轻混匀，然后加入重组质粒Bacmid-MTC28 2 μg后轻轻混匀，静置孵育30 min。然后加至用sf9细胞贴壁铺盘的六孔板中，并补加800 μl unsupplemented Grace’s Medium至6孔板。放入27 ℃培养箱中静置孵育4～6 h。弃去6孔板中的培养混合液，每孔加2 ml Sf-900 Ⅲ 无血清培养基(serum free medium,SFM)(Thermo Fisher Scientific公司)(含50 U/ml 青霉素、50 μg/ml 链霉素和0.125 μg/ml Fungizone®Antimycotic)。27 ℃)培养箱中孵育，随时注意观察转染现象。72 h后收取病毒上清至无菌的EP管，4 ℃避光保存，这就是P1病毒。P1病毒拉梯度转染扩增P2病毒，3 d后收取P2病毒并扩增P3病毒。病毒成功包装扩增的现象为宿主细胞sf9变大、变圆，且细胞呈现颗粒化状态。

(八) MTC28蛋白的表达

P3病毒转染对数生长期的High Five昆虫细胞，P3病毒按照1∶3的比例转染High Five昆虫细胞进行MTC28蛋白的表达。

(九)MTC28蛋白的纯化

3天后收取High Five昆虫细胞表达的上清，上清液经过0.22 μm孔径抽滤后结合到镍柱上，然后用梯度咪唑洗脱目的蛋白。经过试验，发现用10 mmol Tris-Hcl，200 mmol NaCl，350 mmol Imidazole可以洗脱下来MTC28蛋白。

洗脱下来的蛋白继续用Superdex 200 PG分析筛进一步纯化，最终得到高纯度且均质化的MTC28蛋白。

结 果

一、目的基因的扩增

扩增的MTC28的全长结构基因为933 bp，PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳显示，在预期部位出现目的条带。连入6×His-tag标签后条带大小有所增加，但不明显(图 1)。

M：DNA分子标准marker；1：MTC28-6×His-tag PCR条带；2：MTC28 PCR条带图1 PCR扩增MTC28基因电泳结果

二、杆状病毒表达载体的构建

重组质粒pFastbac1-MTC28转染DH10 Bac感受态细菌后，利用同源重组构建重组质粒Bacmid-MTC28。M13引物鉴定后发现重组基因大小为3300 bp左右(图 2)。

M：DNA分子标准marker；1：阴性重组质粒Bacmid-MTC28 PCR条带；2：阳性重组质粒Bacmid-MTC28 PCR条带图2 PCR鉴定重组质粒Bacmid-MTC28基因电泳结果

三、MTC28蛋白的纯化

重组质粒Bacmid-MTC28转染处于对数生长期的sf9昆虫细胞后，包装并扩增P3病毒，之后利用P3病毒转染对数生长期的High Five昆虫细胞进行MTC28蛋白的表达。表达后的蛋白上清液，先后经过亲和层析(镍柱)和分子筛纯化，最终获得高纯度均质化的MTC28蛋白。亲和层析发现，用10 mmol Tris-Hcl，200 mmol NaCl，350 mmol Imidazole可以洗脱下来MTC28蛋白，为进一步获得高纯度和均质化的MTC28蛋白，继续用分子筛Superdex 200 PG进一步纯化，结果显示MTC28在100 ml左右出峰，MTC28蛋白相对分子质量约为28 000(28 kDa)(图 3)。

左侧第一泳道为标准蛋白marker；右侧4个泳道为MTC28蛋白纯化后的样品泳道图3 MTC28分子筛纯化，以及SDS-PAGE(二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)鉴定

讨 论

据世界卫生组织统计显示，全球有近1/3人口感染结核分枝杆菌，每1秒钟都会新增1例患者，尤其是多重耐药菌株的出现及与艾滋病共同感染的发生，更加重了结核病对人类健康的危害[1-2]。快速、有效和灵敏的诊断是控制结核病的关键之一。目前，常用的诊断试剂结核菌素纯蛋白衍生物(PPD)是一种未被明确成分的结核分枝杆菌抗原混合物，其普遍存在于结核分枝杆菌及环境中的非结核分枝杆菌等菌株中，检测时常将卡介苗接种者及活动性肺结核治愈者误检为阳性，而且不能将活动性肺结核与潜伏感染相区别，限制了PPD的临床应用[3]。MTC28是新近从结核分枝杆菌H37Rv株培养滤液中纯化分离出的蛋白抗原，蛋白质编码区(CDS)全长为933个碱基，相对分子质量约为28 000[4]，由310个氨基酸组成。存在于结核分枝杆菌、牛型结核分枝杆菌及少数的卡介菌中，且该蛋白可被大多数结核病患者和结核病感染者的血清所识别。因此，结核分枝杆菌中的MTC28蛋白是一种理想的疫苗候选抗原[5]，有望成为结核病血清学诊断的候选抗原之一[5]。

杆状病毒表达系统是昆虫表达系统中的一种，具有安全性高，对外源基因克隆容量大，重组病毒易于筛选，具有完备的翻译后加工修饰系统和高效表达外源基因的能力等特点[6]，它能对多种目的蛋白进行修饰和加工，使其高效表达且具有一定的生物学活性，在近年得到较为广泛的应用。草地贪夜蛾卵巢组织来源的细胞(Sf9和Sf21)是应用最广泛的杆状病毒表达载体系统(baculovirus ex-pression vector system，BEVS)，可以用于表达多种体外重组的蛋白质[7]。

本试验昆虫表达载体Bacmid-MTC28的成功构建及高纯度均质化MTC28蛋白的获得，较之前原核表达体系和pcDNA3.1(+)-MTC28真核表达质粒的构建有着本质的区别。昆虫细胞更类似于哺乳类细胞，能对蛋白质完成翻译后修饰(如磷酸化、脂肪酸酰化、糖基化等)，其表达的MTC28重组蛋白和天然蛋白更接近，具有更高的生物活性[8]。昆虫细胞悬浮培养极易生长，很快即可适应无血清培养基，用于生物发酵罐的大规模培养。鉴于杆状病毒的宿主细胞仅限于昆虫，其生物安全性更好[9]。目前，重组杆状病毒的构建、细胞培养和蛋白质表达的方法已应用多年，大部分试剂和仪器较易获得，较为经济[10]。

本研究首次在昆虫表达载体中表达并获得了可溶性的MTC28蛋白，经过亲和层析和分子筛Superdex 200 PG纯化，结果显示MTC28蛋白在100 ml左右出峰，MTC28蛋白相对分子质量约为28 000。实验的整体性比较完善，接下来的工作可以重点研究分析MTC28蛋白的结构与其他靶标分子的相互作用。利用昆虫细胞表达体系，经过阶段性纯化获得可溶性的高纯度及均质化的MTC28蛋白，为进一步研究该蛋白的免疫保护效果和相应的结核病疫苗及免疫学研究奠定了重要的实验基础。

[1] Anbarasu S,Selvakumar N,Vanaja K.Newer diagnostic tools in tuberculosis.J Commun Dis，2012,44(3):119-128.

[2] Chiang SS,Swanson DS,Starke JR.New Diagnostics for Childhood Tuberculosis. Infect Dis Clin North Am， 2015,29(3):477-502.

[3] 娄培安, 章辉, 李玲, 等.重组结核杆菌分泌融合蛋白活性鉴定及应用.中国公共卫生,2006,22(5):578-580.

[4] Manca C,Lyashchenko K,Colangeli R,et al.MTC28, a novel 28-kilodalton proline-rich secreted antigen specific for theMycobacteriumtuberculosiscomplex.Infect Immun，1997,65(12):4951-4957.

[5] Slim-Saidi L,Mehiri-Zeghal E,Ghariani A,et al.New methods of diagnosis in tuberculosis. Rev Pneumol Clin，2015,71(2/3):110-121.

[6] Possee RD.Baculoviruses as expression vectors.Curr Opin Biotechnol, 1997,8(5):569-572.

[7] Agrawal N,Malhotra P,Bhatnagar RK.siRNA-directed silencing of transgene expressed in cultured insect cells.Biochem Biophys Res Commun,2004,320(2):428-434.

[8] Shastry BS,Trese MT.Overproduction and partial purification of the Norrie disease gene product, norrin, from a recombinant baculovirus. Biochem Biophys Res Commun,2003,312(1):229-234.

[9] 覃宇翔，姚德生，高琨.OPCML基因在杆状病毒——昆虫细胞 表达系统中的表达.广西医科大学学报,2011,28(1):28-30.

[10] Kromminga A,Sitaru C,Hagel C,et al.Development of an ELISA for the detection of autoantibodies to BP230.Clin Immunol,2004,111(1):146-152.

(本文编辑：范永德)

Expression and purification of the MTC 28 protein in insect cells

ZHUOWen-ji*,LIUZhi-hui,ZHOULin,CHENYan-mei,CHENTao,SUNQi,GUOHui-xin.

*CenterforTuberculosisControlofGuangdongProvince,Guangzhou510630,China

ZHOULin,Email:gdtb@vip.163.com

To clone theMycobacteriumtuberculosis(MTB) mitochondrial translation control (MTC) gene, construct the Bacmid-MTC28 eukaryotic expression plasmid and express MTC28 protein in insect cells. MTC28 gene fragment was amplified from the genome of the MTB H37Rv standard strain by PCR. Then the PCR products and plasmid pFastbac1was digested with EcoRI and XhoI, linked with T4 ligase, the recombinant plasmid pFastbac1-MTC28 was constructed. The pFastbac1-MTC28 was transfected into DH5α competent cells, positive clone was screened by Ampicillin L-B medium and biological amplified by LB liquid medium.The plasmid (pFastbac1-MTC28) extracted from positive clone was identified by PCR and transfected into DH10 Bac competent cells to construct Bacmid-MTC28. The competent cells was amplified with liquid LB medium containing gentamicin, kanamycin and tetracycline, positive clone was screened by blue-white technique. The positive bacteria was amplified by LB liquid medium, extracted the plasmid (Bacmid-MTC28) and identified the target genes by PCR. By liposome transfection, the recombinant plasmid Bacmid-MTC28 was transfected into Sf9 insect cells in logarithmic growth phase, packaged recombinant baculovirus and expressed protein. We successfully constructed the eukaryotic expression plasmid of Bacmid-MTC28, established a baculovirus expression vector and expressed the corresponding proteins. High purity and homogenized MTC28 protein was obtained by purification.

Mycobacteriumtuberculosis； Mitochondrial proteins； Genes, mitochondrial； Transfection； Plasmid； Insect cells

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.021

广东省省级科技计划项目(2014A020212238、2016A020216021);广州市科技计划项目(201604020006)

510630 广州，广东省结核病控制中心(卓文基、周琳、陈燕梅、陈涛、孙琦、郭卉欣)；广州市胸科医院肺部疾病研究所(刘志辉)

周琳,Email:gdtb@vip.163.com

2017-06-19)