别嘌醇联合5－氟尿嘧啶对肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

侯小梅，冯安勇，严海元，冷崇姣

（1.重庆市永川食品药品检验所，重庆402160；2.重庆市计量质量检测研究院第三分院，重庆402160）

·实验研究·

别嘌醇联合5－氟尿嘧啶对肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

侯小梅1，冯安勇2，严海元1，冷崇姣1

（1.重庆市永川食品药品检验所，重庆402160；2.重庆市计量质量检测研究院第三分院，重庆402160）

目的研究别嘌醇（allopurinol，Allo）联合5－氟尿嘧啶（5－Fu）对肝癌HepG2细胞增殖和凋亡的影响。方法用不同质量浓度和配伍的别嘌醇、5－Fu处理HepG2细胞，用CCK－8法检测细胞增殖，用流式细胞术检测细胞凋亡。结果单用别嘌醇对HepG2细胞增殖有微弱的抑制作用；别嘌醇与5－Fu联用能抑制HepG2细胞的增殖，并具有质量浓度（1～3 g／L）和时间（24，48，72 h）依赖性，两药联用比单用5－Fu时抑制率更高；别嘌醇与5－Fu联用时HepG2细胞的凋亡率为39.17%，高于单用5－Fu的30.86%（P＜0.05）。结论别嘌醇与5－Fu联用对肝癌HepG2细胞的增殖抑制和凋亡具有增强作用。

5－氟尿嘧啶；别嘌醇；HepG2细胞；增殖；凋亡

原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤，死亡率高，发病率位居恶性肿瘤第3位。5－氟尿嘧啶（5－Fluorouracil，5－Fu）作为常规化学治疗（简称化疗）药物长期用于治疗原发性肝癌，但化疗药物的非特异性及肿瘤的耐药性会导致化疗过程中产生严重的不良反应，且治疗效果欠佳[1－4]。据报道，别嘌醇（allopurinol，Allo）配合5－Fu化疗能有效减少5－Fu导致的膀胱炎、黏膜炎、骨髓毒性、神经毒性等毒副反应，化疗前使用Allo也是预防肿瘤溶解综合征的常规方法，Allo也是一种治疗肿瘤的辅助常用药[5－9]。本研究拟通过观察Allo联合5－Fu对HepG2细胞株的增殖抑制作用，应用流式细胞仪检测药物作用后的细胞和未处理细胞的凋亡率，探讨Allo联合5－Fu对肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响，并探讨其可能的机制，以减少不良反应。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

酶标仪（Sunrise，奥地利Tecan公司）；FACScan型流式细胞仪（Ecton－Dickinson公司）。人肝癌细胞株HepG2由重庆医科大学病理生理学教研室提供；RPMI1640培养液（美国Gibco公司）；小牛血清（杭州四季青公司）；Allo（北大国际医院集团西南合成制药股份有限公司，纯度为99.8%，药用级），用0.1 mol／L NaOH溶液溶解后加RPMI1640培养液配制贮备液备用（pH＝7.0）；5－Fu（上海旭东海普药业有限公司）；CCK－8（东仁化学科技＜上海＞有限公司）；Annexin V、碘化丙啶（PI，Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 HepG2细胞培养

用10%小牛血清的RPMI1640培养基，在37℃、5%CO2条件下培养HepG2细胞。取对数生长期细胞用不同质量浓度Allo和5－Fu处理。

1.2.2 HepG2细胞增殖影响试验(CCK－8法)

取对数生长期的HepG2细胞4×103／mL，接种于96孔培养板，每孔100μL。培养24 h后，吸去培养液，根据所加药物浓度不同，分为5－Fu组、Allo组、联合(Allo＋5－Fu)组、空白组。用RPMI1640培养液配制药物，药物终质量浓度：5－Fu组为250μg／mL；Allo组为1，2，3μg／mL；联合组为1＋250，2＋250，3＋250μg／m L；空白组加入等体积培养液，然后分别加入96孔培养板（每孔100μL）。每组设3个复孔，置37℃及5%CO2条件下分别培养24，36，48 h。达到培养时间后，每孔加入CCK－8 10μL继续培养4 h，之后用酶标仪测吸光度（A450值），按公式计算细胞抑制率。细胞抑制率（%）＝（1－实验组平均A450值／空白组平均A450值）×100%。

1.2.3 HepG2细胞凋亡影响试验(流式细胞仪)

将培养至对数生长期、密度为5×103／m L的HepG2细胞接种于6孔培养板，每孔2m L，共4组，每组设3个复孔，待细胞贴壁后，吸去培养液，用RPMI1640培养液配制药物，药物终质量浓度：5－Fu组为250μg／mL；Allo组为3μg／mL；联合组为3＋250μg／mL，分别加入到6孔培养板（每孔2m L）；空白组加入等体积培养液。于37℃、5%CO2条件下培养48 h，以1 500 r／min的速率离心7min，收集细胞，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH＝7.4）洗涤3次，最后1次移入1m I离心管中，加入Annexin V、PI染色30min，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 对HepG2细胞增殖的抑制作用

经药物处理24，48，72 h后，250μg／mL的5－Fu可明显抑制细胞的生长，与空白组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。1，2，3μg／m L不同质量浓度组的Allo对HepG2细胞有微弱的抑制作用。当5－Fu与不同质量浓度的Allo联用后，对细胞生长的抑制作用有一定增强，与空白组及单用5－Fu组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05），并呈时间和剂量依赖性。结果表明，Allo与5－Fu联用有协同作用，可增强5－Fu对肝癌HepG2细胞的增殖抑制作用。详见表1。根据结果，建议选择Allo为1μg／m L质量浓度，因为联合组，Allo质量浓度差异对5－Fu的作用不显著。

表1 各组药物对HepG2细胞增殖的抑制作用（，n＝3）

表1 各组药物对HepG2细胞增殖的抑制作用（，n＝3）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与5－Fu组比较，bP＜0.05。

组别质量浓度（ g／mL）空白组5－Fu组Allo组24 h 48 h 72 h A450值抑制率（%）A450值抑制率（%）A450值抑制率（%）0 250 123联合组1＋250 2＋250 3＋250 0.654±0.007 0.409±0.018a0.648±0.023 0.624±0.003a0.617±0.006a0.387±0.009ab0.356±0.003ab0.325±0.006ab37.46 0.89 4.57 5.64 40.73 45.58 50.27 0.929±0.008 0.566±0.073a0.906±0.029 0.897±0.010a0.868±0.008a0.467±0.036ab0.418±0.033ab0.404±0.017ab39.10 2.55 3.52 6.56 49.78 54.99 56.53 1.080±0.004 0.483±0.014a1.064±0.010 1.032±0.015 0.986±0.006a0.347±0.008ab0.332±0.011ab0.325±0.006ab55.28 1.45 4.40 8.70 67.84 69.26 69.94

2.2 对HepG2细胞凋亡的影响

各组药物作用于HepG2细胞48 h后，通过流式细胞仪，用Annexin V／PI染色后检测细胞凋亡。结果显示，5－Fu（250μg／mL）组和联合组（3＋250）细胞早期凋亡及晚期凋亡或坏死细胞较空白组均明显增加，凋亡率分别上升为（30.86±1.72）%和（39.17±2.43）%，较空白组的（3.86±0.83）%差异显著（P＜0.05）。Allo组较空白组细胞早期凋亡略有增加（P＜0.05），晚期凋亡或坏死细胞差异性不大（P＞0.05）。两药联用后，与单用5－Fu组相比，HepG2细胞的早期凋亡和凋亡率明显增加（P＜0.05），而晚期凋亡或坏死细胞增加不明显（P＞0.05），凋亡率差异显著（P＜0.05）。详见表2和图1。

3 讨论

肝癌为常见的消化道肿瘤，具有高死亡率、早期症状隐匿、预后差等特点[10]。5－Fu作为抗肿瘤药物已应用多年，其临床疗效较差，但在目前消化道恶性肿瘤化疗中仍为首选，在使用5－Fu常规剂量进行化疗时，常会出现消化道不良反应及骨髓抑制等不良反应，这些都限制了5－Fu在肝癌治疗中的应用，怎样合理应用目前尚无统一结论。因此，寻求一种与5－Fu联用后能增强其作用效果，并减少其不良反应的新型化疗方案在对肝癌的治疗上具有积极意义，如何解决化疗药物在治疗过程中的耐药性已成为肝癌治疗的关键[11－13]。

表2 各组药物对HepG2细胞凋亡的影响（，n＝3）

表2 各组药物对HepG2细胞凋亡的影响（，n＝3）

注：与空白组比较，aP＜0.05；与5－Fu组比较，bP＜0.05。

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A.空白组B.Allo组C.5－Fu组D.联合组注：纵、横坐标分别为采用PI和Annexin V为染料时的荧光强度。图1各药物组对肝癌HepG2细胞凋亡的影响（48 h）

本研究通过体外细胞毒性试验观察了Allo、5－Fu单药及联合应用对肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用。CCK－8法检测结果表明，与空白组及5－Fu组相比，Allo对肝癌HepG2细胞生长的抑制作用并不显著，当其与5－Fu联合使用后，可明显抑制HepG2细胞的增殖作用，提示二者具有协同增效作用。流式细胞试验结果进一步证实，5－Fu与Allo联用的抑制率较5－Fu单用时明显提高，存在抑制增殖机制，可能还存在促细胞凋亡机制。其机制可能是别嘌醇及其代谢产物异黄嘌呤均能抑制黄嘌呤氧化酶，而黄嘌呤氧化酶是肿瘤增殖促进剂，通过抑制黄嘌呤氧化酶从而抑制HepG2细胞增殖，诱导其凋亡；其次，Allo也可提高肝癌HepG2细胞对5－Fu的敏感性[14－15]，两药联用起协同作用。但本研究仅限于体外试验，与体内具体情况有很大差异，且不同病理类型的肝癌细胞对药物的敏感性不同，因此其确切机制还需进一步研究。

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Influence of A llopurinol Com bined w ith 5－Fluorouracil on Proliferation and Apop tosis of Liver Cancer HepG2 Cells

Hou Xiaomei1，Feng Anyong2，Yan Haiyuan1，Leng Chongjiao1
（1.Chongqing Yongchuan Institute for Food and Drug Control，Chongqing，China 402160；2.The Third Branch of Chongqing Academy of Metrology and Quality Inspection，Chongqing，China 402160）

Objective To study the influence of Allopurinol combined with 5－Fluorouracil on the proliferation and apoptosis of liver cancer HepG2 cells.M ethods The HepG2 cells were treated by different concentrations and combinations of Allopwrind，5－Fluorouracil.CCK－8 was used to measure HepG2 cells proliferation，and flow cytometry was used to examine the apoptosis of HepG2 cells.Resu lts The inhibition of HepG2 cells apoptosis reacted by Allopurinol was weak，in combination inhibited the proliferation of HepG2 cells in a time（24，48，72 h）and concentration dependent（1－3μg／L）manner.Allopurinol combined with 5－Fluorouracil had stronger inhibitory effect than that was used alone.The apoptosis rate of HepG2 cells in the combination treatment group was 39.17%，which was significantly higher than 30.86%in the 5－Fluorouracil group（P＜0.05）.Conclusion Allopurinol combined with 5－Fluorouracil has enhanced effect on the proliferation and apoptosis of HepG2 cells.

5－Fluorouracil；Allopurinol；HepG2 cells；proliferation；apoptosis

R965.2；R979.1

A

1006－4931(2017)10－0018－03

2017－01－29)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.10.005

侯小梅（1985－），女，硕士研究生，工程师，研究方向为药物质量控制和体内分析，（电话）023－49653339。

冷崇姣(1980－)，女，大学本科，高级工程师，研究方向为药物细胞学，(电子信箱)604033643＠qq.com。