叶下珠饮片质量标准研究

韩越，邹恺平，周琴妹，张源

（南京中医药大学附属医院，江苏南京210029）

·实验研究·

叶下珠饮片质量标准研究

韩越，邹恺平，周琴妹，张源

（南京中医药大学附属医院，江苏南京210029）

目的建立叶下珠饮片的质量标准，提高其质量控制水平。方法采用薄层色谱（TLC）法对叶下珠饮片中的没食子酸进行定性鉴别；以没食子酸和柯里拉京为指标成分，采用高效液相色谱（HPLC）法测定含量。结果叶下珠饮片没食子酸薄层色谱中，在与对照品溶液同一位置显相同颜色的斑点。HPLC定量分析结果中，没食子酸的线性回归方程为Y＝30.715X－0.172 9，质量浓度线性范围为0.66～26.40 g／mL（r＝1.000 0），平均回收率为97.99%，RSD＝1.44%（n＝6）；柯里拉京的线性回归方程为Y＝13.192X＋1.494 6，质量浓度线性范围为1.79～71.84 g／mL（r＝0.999 8），平均回收率为95.68%，RSD＝1.04%（n＝6）。结论该方法简单易行，专属性强，重复性好，可作为叶下珠饮片的质量控制方法。

叶下珠；饮片；质量标准；薄层色谱法；高效液相色谱法

叶下珠为大戟科叶下珠属植物叶下珠Phyllanthus urinaria L.的干燥全草，中医应用广泛，具有清热利尿、平肝解毒功效，对肝炎、肠炎、泌尿系统感染等有良好疗效。叶下珠属植物含有木脂素、萜类、黄酮、鞣质、生物碱等多种化合物[1]，其中酚酸类为叶下珠的主要有效成分，没食子酸、柯里拉京和短叶苏木酚为含量相对较高的酚酸类成分[2]。目前，尚无叶下珠饮片的质量标准，为了提高其质量控制水平，本研究中参照《江苏省中药饮片炮制规范》修订工作的要求，对10个批次的叶下珠饮片进行了薄层色谱（TLC）鉴别，并测定了水分、总灰分、浸出物、没食子酸和柯里拉京的含量，为叶下珠饮片质量标准的制订提供了试验基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

AX 224ZH／E型万分之一电子天平，AR 2140型十万分之一电子天平（美国OHAUSCorp公司）；HH－2型数显恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；RT－02A型粉碎机（上海罗技机械设备有限公司，单次最大粉碎能力100 g）；SK6200H型超声清洗仪（上海科导超声仪器有限公司）；1260S型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；DHG－9123A型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏实验设备有限公司）；RJM－28－10型茂福炉（沈阳市电炉厂）。

1.2 试药

没食子酸对照品（批号为16081904，CAS：149－91－7），柯里拉京对照品（批号为16080905，CAS：23094－69－1），叶下珠对照药材（批号为121374－200401），均购自中国食品药品检定研究院；叶下珠饮片经江苏省药品检验所胡浩彬主任鉴定为叶下株Phyllanthus urinaria L.的干燥全草，均购自安徽井泉集团中药饮片有限公司（批号分别为20160101，20160102，20160103，20160201，20160202，20160203，20160301，20160302，20160303，20160401）；聚酰胺薄膜（供薄层层析用，批号为20120210，浙江台州市路桥四甲生化塑料厂）；聚酰胺－6－薄膜（供薄层层析用，批号为20150413，国药集团化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 鉴别方法

取叶下珠饮片(批号为20160102)适量，用粉碎机研为粉末，取叶下珠粉末1.0 g，加50%甲醇50mL，超声（功率280W，频率50 kHz）0.5 h，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1mL溶解，作为供试品溶液。另取叶下珠对照药材，同法制备叶下珠对照药材溶液。取没食子酸对照品，加甲醇制成每1m L含1mg的溶液，作为对照品溶液。

照薄层色谱法[2015年版《中国药典（四部）》通则0502]试验，吸取上述溶液各2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以冰乙酸作为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1%的三氯化铁乙醇溶液，晾干，日光下检视。供试品溶液色谱中，在与对照品、对照药材溶液色谱相应位置显相同颜色的斑点[3]，见图1。

1.供试品溶液2.对照品溶液3.叶下珠对照药材溶液图1叶下珠与没食子酸薄层色谱图

2.1.2 耐用性考察

取10个不同批次的叶下珠饮片，按2.1.1项下方法制备供试品溶液，取10份供试品溶液与对照品溶液，每份各1μL，分别点于聚酰胺－6－薄膜和聚酰胺薄膜，按拟订方法进行试验，结果重复性良好，见图2。

1－10.不同批次的叶下珠饮片11.没食子酸对照品A.聚酰胺－6－薄膜B.聚酰胺薄膜图2 10批次叶下珠饮片没食子酸薄层色谱图

2.2 水分、总灰分测定

照2015年版《中国药典（四部）》通则0832第二法中的水分测定法及通则2302中的总灰分测定法，对10批叶下珠饮片进行水分及总灰分测定。结果见表1。

2.3 浸出物测定

取10批不同批次叶下珠饮片粉末各4g，精密称定，用70%乙醇作溶剂，照2015年版《中国药典（四部）》通则2201醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定。结果见表1。

2.4 含量测定

2.4.1 溶液制备

供试品溶液：称取叶下珠对照药材200.49 mg，精密称定，置100m L容量瓶中，加50%甲醇适量，加热回流1.5 h，过滤，放冷，加50%甲醇补足至刻度，摇匀，0.45μm滤膜滤过，即得。

表1 叶下珠饮片相关含量测定结果（%）

混合对照品溶液：称取没食子酸、柯里拉京对照品适量，精密称定，置容量瓶中，加50%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1 m L含没食子酸26.4μg、柯里拉京71.84μg的混合对照品溶液。

2.4.2 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Hypersil C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：A为0.1%磷酸溶液，B为乙腈，梯度洗脱，0～5 min时95%A，5～35 min时95%A～85%A，35～38 min时85%A～95%A，38～45 min时95%A；检测波长：270 nm；柱温：35℃；流速：1.0 m L／min；进样量：10μL。在此色谱条件下的色谱图见图3。

1.没食子酸2.柯里拉京A.混合对照品溶液B.供试品溶液图3高效液相色谱图

2.4.3 方法学考察

线性关系考察：取混合对照品溶液，稀释0，2，4，8，20，40倍。吸取适量，精密称定，按拟订色谱条件进样测定。以峰面积值（Y）为纵坐标、对照品质量浓度（X）为横坐标进行线性回归，得没食子酸、柯里拉京的回归方程分别为Y＝30.715X－0.172 9（r＝1.000 0）和Y＝13.192X＋1.494 6（r＝0.999 8），质量浓度线性范围分别为0.66～26.4μg／mL及1.79～71.84μg／mL。结果表明，各对照品溶液的质量浓度与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取2.4.1项下混合对照品溶液，连续进样6次，计算没食子酸、柯里拉京对照品含量。结果的RSD分别为0.20%和0.15%（n＝6），均小于5%，表明仪器精密度良好。详见表2。

重复性试验：精密称取叶下珠对照药材200mg，共6份，按2.4.1项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算没食子酸、柯里拉京的含量。结果没食子酸、柯里拉京的平均含量分别为2.06μg／mL和36.82μg／mL，RSD分别为0.55%和0.34%（n＝6），均小于5%，表明该方法的重复性良好，详见表3。

表2 精密度试验结果（n＝6）

稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24 h时进样测定，计算其含量。结果没食子酸、柯里拉京含量的RSD分别为0.80%和0.96%（n＝6），均小于5%，表明供试品溶液在24 h内稳定，详见表4。

表3 重复性试验结果（n＝6）

表4 稳定性试验结果（n＝6）

表5 加样回收试验结果（n＝6）

加样回收试验：精密称取叶下珠对照药材200mg，共6份，置100mL容量瓶中，分别精密加入一定量的没食子酸和柯里拉京对照品溶液，加50%甲醇定容至刻度，摇匀，过滤，进样测定，计算回收率，见表5。

2.4.4 样品含量测定

取10批不同批次的叶下珠饮片，依法制备供试品溶液，进样测定，每批平行测定2次计算峰面积，按拟订方法计算没食子酸和柯里拉京的含量。结果见表1。

3 讨论

本研究中对叶下珠饮片中所含酚酸类成分与黄酮类成分进行了TLC考察，选用没食子酸、芦丁、槲皮素作为对照品，经过比较，叶下珠饮片所含主要成分没食子酸斑点清晰，方法简便可行，重复性好，可作为叶下珠饮片的定性鉴别依据。

含量测定项中对比了使用50%甲醇进行超声提取15，30min和进行加热回流1，1.5 h，结果加热回流1.5 h的样品中没食子酸和柯里拉京的含量最高，故选用50%甲醇加热回流1.5 h作为提取方法。本研究中参考文献[4－8]的方法，比较了乙腈－0.2%冰醋酸水、甲醇－0.1%磷酸溶液、乙腈－0.1%磷酸溶液等不同流动相及不同流动相比例对各种化合物的分离效果，结果发现，没食子酸和柯里拉京在乙腈－0.1%磷酸溶液中的峰形和分离度均较好，故以此作为流动相进行梯度洗脱，对没食子酸和柯里拉京的含量进行测定。

本研究中收集了10批不同批次的叶下珠饮片进行炮制规范研究，研究结果能充分反映叶下珠饮片的实际情况。根据测定结果，按照《江苏省中药饮片炮制规范》中药质量标准研究制定技术要求，并参考2015年版《中国药典（四部）》中车前草、积雪草和金钱草等全草类药材的标准，建议规定叶下珠饮片的水分不得过12.0%，总灰分不得过15.0%；照通则2201醇溶性浸出物测定法项下的热浸法测定，用70%乙醇作溶剂，不得少于15.0%；照高效液相色谱法（通则0512）测定，没食子酸含量不得少于0.03%，柯里拉京含量不得少于0.30%。

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[2]闫小玉，孙蒙，杨国光，等.RP－HPLC法同时测定叶下珠中没食子酸、柯里拉京和短叶苏木酚的含量[J].沈阳药科大学学报，2012，29（1）：45－48.

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[6]张文霞，戴卫波.叶下珠质量控制研究进展[J].今日药学，2014，24（9）：693－696.

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Quality Standard of Phyllanthus Urinaria

Han Yue，Zou Kaiping，Zhou Qinmei，Zhang Yuan
（Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu，China 210029）

Objective To establish the quality standard of Phyllanthus Urinaria and improve its quality control level.M ethods Gallic acid and corilagin were selected as index ingredients.The qualitative and quantitative analyses were performed by TLC and HPLC methods.Resu lts The TLC spots of gallic acid had similar color with the reference solution at the same position.The results of quantitative analyses showed that the linear equation of gallic acid is Y＝30.715X－0.172 9，the liner range was 0.66－26.40μg／m L（r＝1.000 0）and the average recovery was 97.99%，RSD＝1.44%（n＝6）；the linear equation of corilagin is Y＝13.192X＋1.494 6，the liner range was 1.79－71.84μg／mL（r＝0.999 8），and average recovery was 95.68%，RSD＝1.04%（n＝6）.Conclusion The method is convenient，accurate，repeatable and specific，which can be used for the quality control of Phyllanthus Urinaria.

Phyllanthus Urinaria；crude drug；quality standard；TLC；HPLC

R282.5；R284.1

A

1006－4931(2017)10－0014－04

2017－02－10)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.10.004

江苏省中药饮片炮制规范修订专项[苏药会字[2015]30号]。

韩越，大学本科，副主任中药师，研究方向为中药资源与鉴定，（电话）025－86617141－20136（电子信箱）hanyuehan123＠yeah.net。

张源，大学本科，主任中药师，研究方向为中药制剂，（电话）025－86614204（电子信箱）2217764733＠qq.com。