电针结合中频治疗对SUI大鼠盆底组织Calpain的影响及治疗机制研究*

邢艳丽,高 潇△,张 立,樊宇婷，夏 梦，卜亚龙

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

电针结合中频治疗对SUI大鼠盆底组织Calpain的影响及治疗机制研究*

邢艳丽1,高 潇1△,张 立1,樊宇婷2，夏 梦2，卜亚龙2

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

目的：通过观察电针结合中频治疗对压力性尿失禁(SUI)大鼠盆底组织中钙蛋白酶(Calpain)表达和CollagenⅠ、Ⅲ含量以及Ⅰ/Ⅲ比值的影响，来阐释电针结合中频治疗SUI的部分机制，为电针与中频相结合治疗SUI的临床疗效判定研究提供基于动物模型的实验研究依据。方法：受试模型大鼠(100只)参照随机数列表分为空白组(A组)、模型组(B组)、电针组(C组)、中频组(D组)和电针结合中频组(E组)，每组20只。采用阴道扩张压迫及双侧卵巢切除术，制备SUI大鼠模型。分别于干预前、第7天、干预第14天随机选取不同组各10只受试大鼠进行最大膀胱容量测定(MBC)，并处死取材，应用酶联免疫法观察盆底组织中CollagenⅠ、Ⅲ含量以及Ⅰ/Ⅲ比值的变化。结果：除模型组外，其余各组SUI大鼠的临床症状明显改善，针康组MBC、Calpain的含量、CollagenⅠ、Ⅲ含量以及Ⅰ/Ⅲ比值明显高于中频组与电针组(P<0.05)。结论：电针结合中频治疗能有效增大MBC，改善SUI大鼠的临床症状,同时能够降低大鼠盆底组织中Calpain的表达，进而增加CollagenⅠ、Ⅲ含量以及Ⅰ/Ⅲ比值。

电针;中频治疗；压力性尿失禁；脉冲调制中频电疗法；钙蛋白酶；胶原蛋白

压力性尿失禁(Stress urinary incontinence，SUI)是中老年妇女常见病，主要表现为在身体用力、打喷嚏或增加腹压的情况下，尿液不自主的从尿道口流出[1]。大量的临床流行病学研究表明，SUI的发病与肥胖、年龄、妊娠、分娩、盆腔手术史等有关，同时基础研究显示, 某些物质如NO、血管活性肠肽、弹性蛋白、Calpain、LOX、转化生长因子β1等可通过影响胶原而参与SUI的发病[2-4]。因此改善生活方式，注重保护盆底结构，避免损伤，及时就诊，进行盆底训练与康复是防治SUI的综合措施。电针结合中频治疗[5]作为一种治疗新策略，将针刺治疗与现代康复技术有机结合起来。本研究通过将具有快速最大功能性电刺激中频脉冲电流导入体内产生刺激，并同时结合针刺治疗来观察对SUI大鼠盆底组织中Calpain和CollagenⅠ、Ⅲ含量以及Ⅰ/Ⅲ比值的影响，为电针与中频相结合治疗SUI的临床疗效判定研究提供基于动物模型的实验研究依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

全部受试雌性SD大鼠体质量(280±20)g均购自黑龙江中医药大学动物实验中心。参照随机数字表赋予每只受试大鼠1个三位随机数，并按照随机数的大小将全部受试大鼠随机分为空白组(A组)、模型组(B组)、电针组(C组)、中频组(D组)和电针结合中频组(E组)，每组20只，A组、B组不进行干预，C组予电针干预，D组予中频干预，E组予电针结合中频干预。

1.2 实验试剂及设备

蛋白浓度测定试剂盒(上海碧云天生物科技有限公司)；大鼠赖氨酰氧化酶ELISA试剂盒(上海信帆生物科技有限公司)；大鼠钙蛋白酶ELISA试剂盒(上海信帆生物科技有限公司)；美兰(天津凯通化学试剂有限公司)；水合氯醛(天津市光复精细化工研究所)；PBS(国产分析纯)；多功能酶标仪(瑞士TECAN M200 PRO)；MTZ-M多功能脉冲调制中频(北京御健康复医疗仪器有限公司)；长城牌KWD-808I脉冲电疗仪(江苏武进医疗器械厂)；0.35 mm×40 mm安迪牌针灸针(贵州安迪药械有限公司)。

1.3 动物造模

1.3.1 模型制备 采用阴道扩张压迫及双侧卵巢切除术，制备SUI大鼠模型。受试大鼠经适应性喂养1周后开始造模。将受试大鼠麻醉后仰卧位固定，排空膀胱，将修剪光滑的F8球导管前端插入大鼠阴道3 cm左右，注水扩张阴道，对阴道口进行“8”字缝合，转换大鼠体位，俯卧位固定，使耻骨联合与桌沿相切，导管下端悬挂100 g重物，持续压迫6 h后撤除。压迫阴道1周后行双侧卵巢切除术：在大鼠背部正中做约3 cm纵行切口，将开口牵拉向一侧，找到包裹在脂肪内的粉色卵巢，结扎卵巢血管，摘除卵巢，将组织送回腹腔内缝合肌肉，再将开口牵向对侧，操作同上摘除另一侧卵巢[6-8]。

1.3.2 检测模型是否成功 喷嚏实验：排空大鼠膀胱，向膀胱注入混有美兰的生理盐水，注射量为所测膀胱最大容量(MBC)的一半，剪一段鼠须刺激大鼠鼻孔至其打喷嚏，观察尿道口是否有蓝色液体流出，如有则造模成功，没有则不成功。

1.4 操作方法

A组与B组受试大鼠不予任何干预。C组受试大鼠参照卫生部“十二五”规划教材《针灸治疗学》选气海穴、关元穴、足三里穴、三阴交穴，应用0.35 mm×40 mm安迪牌针灸针毫针针刺，气海穴与关元穴连接电针，选用疏密波干预20 min，每日1次，持续干预14天。D组受试大鼠选用MTZ-M型调制中频电疗机，设置干预处方输出为2 Hz，将改良的正极电极片贴于受试大鼠的会阴穴、负极电极片贴于受试大鼠的中极穴，刺激强度以大鼠不产生挣扎为宜，每次干预20 min，持续干预14天。E组采用电针结合中频干预，电针干预方法同电针组(C组)，中频干预方法同中频组(D组)，干预20 min，每日1次，持续干预14天。

1.5 取材与检验

1.5.1 取材 B组、C组、D组及E组受试大鼠分别于干预前、干预后第7天、干预后第14天随机选取10只大鼠进行MBC测定；A组受试大鼠进组后当天、第7天、第14天分3次随机选取10只大鼠进行MBC测定。干预第7天、第14天后处死大鼠，取耻骨联合和尾骨之间走行的耻骨肌和尿道下阴道壁、耻骨尿道韧带和尿道周围结缔组织为标本，标本用生理盐水冲洗干净后，用液氮研磨碎、裂解液裂解，匀浆处理后冰上孵育30 min，并用枪头吹打匀浆液，裂解后离心，取上清液，置于-80℃冰箱低温保存备用，计算出上样体积后行酶联免疫法检测。

1.5.2 最大膀胱容量 将受试大鼠麻醉后仰卧位固定,将涂有液态石蜡的留置针前端透明套管经尿道插入膀胱内，排空膀胱。排空管内空气以无菌生理盐水注满留置针延长管，白色帽端与装有蓝色美兰溶液的20 ml无菌注射器相连，以36 ml/h的速度将蓝色的美兰溶液注入膀胱，记录尿道口溢出第1滴蓝色液体时所注入的美兰体积即为最大膀胱容量。

1.5.3 酶联免疫法检测 将稀释的标准品加样50 μg于酶标板上，再加入待测样品；封板后置于37℃电热恒温干燥箱内，温育30 min，揭掉封板膜，去液甩干，每孔加满稀释30倍的洗涤液，静置30 s弃去，如此重复5次拍干；再将每孔加入酶标试剂50 μl，空白孔除外，再次温育、洗涤，加入显色剂A 50 μl、B 50 μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10 min，加终止液50 μl，以空白孔凋零，450 nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)，测定在加终止液15 min内进行。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 对大鼠最大膀胱容量的影响

见表1。同一时间点：干预前：B、C、D、E组与A组比较P<0.05；B、C、D、E组组间比较P>0.05。7天：B、C、D、E组与A组比较P<0.05；C、D、E组与B组比较P<0.05；C、E组与D组比较P>0.05；E组与C组比较P<0.05。14天：B、C、D、E组与A组比较P<0.05；C、D、E组与B组比较P<0.05；E组与C、D组比较P<0.05；D组与C组比较P<0.05。

不同时间点：A组内：干预前、7天、14天组内比较P>0.05。B、C、D、E组内：14天与7天、干预前比较P<0.05；7天与干预前比较P<0.05。

表1 干预前后各组大鼠MBC测定结果

注：与B组比较,▲P<0.05；与C组比较，□P<0.05；与D组比较，■P<0.05

2.2 大鼠盆底组织Calpain的表达

见表2。同一时间点：7天：A、C、D、E组与B组比较P<0.05;A、E、D组与C组比较P<0.05;A、E组与D组比较P<0.05;A组与E组比较P<0.05。14天：A、C、D、E组与B组比较P<0.05;A、D、E组与C组比较P<0.05;A、E组与D组比较P<0.05;A组与E组比较P>0.05。

不同时间点：A组、B组内：7天、14天组内比较P>0.05。C、D、E组内：14天与7天比较P<0.05。

表2 各组大鼠盆底组织中Calpain的测定结果±s)

注：与B组比较,▲P<0.05；与C组比较,□P<0.05；与D组比较,■P<0.05

2.3 大鼠盆底组织CollagenⅠ、Ⅲ含量以及Ⅰ/Ⅲ比值的变化

表3 各组大鼠盆底CollagenⅠ、Ⅲ含量(μg/L)以及Ⅰ/Ⅲ比值的测定结果

注：相同时间点:与B组比较，▲P<0.05；与C组比较，□P<0.05；与D组比较，■P<0.05

见表3。CollagenⅠ：同一时间点：7天与14天：A、C、D、E组与B组比较P<0.05;A、E、D组与C组比较P<0.05;A、E组与D组比较P<0.05。但7天：A组与E组比较P<0.05。14天：A组与E组比较P>0.05。不同时间点：A组内：7天、14天组内比较P>0.05;B、C、D、E组内：14天与7天比较P<0.05。

CollagenⅢ：同一时间点：7天：A、E、D、C组与B组比较P<0.05;A组与E组、D组、C组比较P<0.05;E组、D组、C组组间比较P>0.05。14天：A、E、D、C组与B组比较P<0.05;E、D组与A、C组比较P<0.05；A组与C组比较：P>0.05；E组与D组比较P<0.05。不同时间点：A、B组内：7天、14天组内比较P>0.05;C、D、E组内：14天与7天比较P<0.05。

Ⅰ/Ⅲ比值:同一时间点：7天：A组与B、C、D、E组比较：P<0.05;E、D组与B组比较P<0.05；C组与B组比较P>0.05;E组与C组比较P<0.05；D组与C组比较P>0.05。14天：A、C、D、E组与B组比较P<0.05;A、D、E组与C组比较P<0.05;A、E组与D组比较P<0.05;A组与E组比较P>0.05。不同时间点：A、B组内：7天、14天组内比较P>0.05;C、D、E组内：14天与7天比较P<0.05。

3 讨论

压力性尿失禁(SUI)是一种主要发病于中老年女性的盆底功能障碍性疾病。国际控尿协会(Intemational Continence Society,ICS)认为SUI的发病实质为：由于咳嗽、大笑或打喷嚏造成盆内支撑组织及膀胱逼尿肌无法拮抗突然增高的腹压，导致尿液不自主流出。从结构上分析[9]，由于内分泌疾病及年龄原因导致盆内维持脏器解剖位置的结缔组织功能障碍，也就是说对盆底脏器起支撑及固定作用的肌肉、筋膜及韧带功能障碍，致使骨盆及容纳的脏器失去了原有的支撑及固定功能，最终导致与憋尿相关的盆底支撑组织无法抵御腹腔突然增高的压力，由此导致SUI的发病。这种由于内分泌疾病及年龄原因导致的盆底支撑性肌肉、筋膜及韧带功能障碍，在微观上主要表现为结缔组织分子结构的异常。

Calpain是一类钙离子依赖性的水解半胱氨酸的蛋白酶，它广泛存在于盆底各脏器及支撑性结缔组织中，在通常生理状态下Calpain主要参与细胞骨架和细胞膜附着的构型重建，同时也参与一些信号通路的转导。如果在病理状态下Calpain被激活可以导致起细胞支撑作用的蛋白分解的速度快于合成速度，这种蛋白质的水解会造成细胞骨架的破坏，从而引起细胞结构的破坏和功能的异常变化，Calpain在盆内肌肉中的肌细胞内部含量较大，尤其是在与盆内起支撑作用的z线含量最高，它高度参与相应肌肉的肌原纤维的降解过程。相关实验研究提示[10],Calpain的表达可以使z线肌原纤维降解并释放出肌丝，其进一步解离出肌球蛋白和肌动蛋白，即使结构及功能完整尚未降解的z线肌原纤维亦会由于Calpain的表达导致该肌原纤维缩力量减弱，最终导致患者盆底结缔组织松弛，支持力下降，而除了肌原纤维，各型胶原、弹性纤维也都是Calpain的作用底物。韧带和筋膜这些支持结构的主要成分就是胶原蛋白，一般认为CollagenⅠ与CollagenⅢ是这些胶原蛋白的主要成分，其中CollagenⅠ胶原直径较粗具有很高的抗张强度，所以认为其与支持结构的支持能力及强度密切相关。CollagenⅢ型胶原直径较细，它具有较好的延展性，所以认为其与支持结构的弹性密切相关。CollagenⅠ与CollagenⅢ通过纤连蛋白与蛋白聚糖连接在一起，二者之间由广泛的共价交联互相交织构成多层次、多方面、复杂的三维空间结构，从而维持盆底筋膜韧带的支持功能。Calpain过度激活作用于肌原纤维及胶原蛋白，导致肌原纤维的溶解(至少也是肌原纤维收缩功能的下降)及胶原蛋白的破坏，致使筋膜韧带这些盆底支持结构失去应有的生物力学性质，从而导致盆底松弛和控尿基质减弱发生SUI。

本研究基于传统中医理论及现代康复思想，采用电针结合中频治疗本病，在电针治疗的同时将快速最大功能性电刺激通过极片作用于会阴穴[11-12]，通过调制的脉冲中频电刺激影响阴部神经，引起会阴浅横肌、肛门外括约肌、肛提肌以及相应筋膜会合而成的会阴中心腱的剧烈收缩，由此激发盆底肌的牵张反射，引起盆底肌肉力量、张力的正性改变[13-17]。本实验结果显示，B组大鼠Calpain含量明显高于A组、C组、D组和E组，C组、D组和E组大鼠在治疗后盆底组织中Calpain表达明显下降，筋膜与韧带中CollagenⅠ及CollagenⅢ的表达明显上升，同时相应组内受试大鼠的最大膀胱容量的提高与Calpain、CollagenⅠ及CollagenⅢ的表达呈正相关，由此笔者推断受试模型大鼠临床症状改善与Calpain表达的抑制及CollagenⅠ及CollagenⅢ表达的促进密切相关，而且电针结合中频较单独应用电针或中频电治疗更好的提高受试大鼠的最大膀胱容量，抑制Calpain的表达及促进CollagenⅠ及CollagenⅢ的表达。

综上所述，本研究方法可以提高受试大鼠的最大膀胱容量改善其膀胱功能；抑制Calpain在盆底组织中的表达，来抑制盆内支撑作用肌肉肌原纤维的溶解，维持盆内支撑作用肌肉肌原纤维收缩功能；促进CollagenⅠ及CollagenⅢ的表达，从而维持盆内支撑作用的筋膜韧带的结构强度及弹性。也就是说，电针结合中频疗法从改善盆内组织的物理机械性质稳定性，增强了盆内支持和控尿结构的抗张力途径达到治疗SUI的目的。

[1] 连爱霞,张伟,王松.经皮穴位电刺激治疗轻中度女性压力性尿失禁:随机对照研究[J].中国针灸,2015(4):327-329

[2] 叶明,唐家龄,冯琼,等.女性尿失禁患者盆底组织胶原状态的研究[J].实用妇产科杂志,2007(2):84-129

[3] 王漫丽,王鲁文.SUI患者盆底支持组织中MMP-3、TIMP-3、TGF-β1和CollagenⅢ表达的研究进展[J].中国妇幼健康研究,2013(6):968-971

[4] 周华,王漫丽,王鲁文.女性压力性尿失禁患者盆底组织MMP-3和CollagenⅢ的研究[J].中国现代医生,2008(10):1-3

[5] 唐强,刘宏光,王艳,等.针康法对局灶性脑缺血大鼠前肢运动功能及缺血区突触素和生长相关蛋白-43表达的影响[J].中国康复理论与实践,2011(10):973-976

[6] 黄健.压力性尿失禁大鼠模型的建立及其盆底肌纤维损伤变化的研究[D].上海：复旦大学,2010

[7] 廖国龙,傅强.压力性尿失禁大鼠模型检测的研究现状[J].现代泌尿外科杂志,2010(1):76-78

[8] 廖国龙,傅强,宋小飞,等.三种压力性尿失禁大鼠模型的比较研究[J].临床泌尿外科杂志,2011(1):55-61

[9] 朱兰.女性盆底支持组织解剖及其功能障碍性疾病的基础研究[J].中国实用妇科与产科杂志,2005(4):18-19

[10] 许梓荣,胡彩虹,李卫芬.钙蛋白酶系统的结构、活性调节及其在骨骼肌生长中的作用[J].中国畜牧杂志,2002(2):44-46

[11] 姜俊,严振国,张建华,等.会阴穴的应用解剖观察[J].上海针灸杂志,2003(7):31-32

[12] 梁娇,黄培兴.盆底康复治疗仪结合针灸会阴穴治疗女性盆底功能障碍的临床分析[J].中国妇幼保健,2014(28):4658-4661

[13] 高潇,邢艳丽,董施秋,等.针刺配合穴位中频电刺激对女性压力性尿失禁的影响[J].针灸临床杂志,2013(8):15-16

[14] 闫珺,董施秋,张广美.调制中频电刺激治疗产后子宫脱垂的临床观察[J].现代养生,2014,5(10):55-56

[15] 高潇,邢艳丽,董施秋,等.穴位中频电刺激对女性压力性尿失禁的疗效观察[J].中医药信息,2013(5):106-107

[16] 夏梦,高潇,邢艳丽,等.穴位中频电刺激治疗子宫脱垂的疗效观察[J].中医药学报,2013(4):90-91

[17] 邢艳丽，高潇，张立，等.调制中频脉冲电刺激SUI大鼠会阴穴对盆底组织LOX的影响及治疗机制的研究[J].针灸临床杂志，2017，33(1):53-55

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Effects of the Calpain Expression in the Pelvic Tissue of the SUI Rats Treatedby Electro-acupuncture Combined with Intermediate Frequency Electrotherapy

XING Yan-li1,GAO Xiao1△,ZHANG Li1,FAN Yu-ting2,XIA Meng2,PIAO Ya-long2

(1.TheSecondAffiliatedHospitalofHeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150001,China;2.HeilongjiangUniversityofChineseMedicine,Harbin150040,China)

Objective： To observe the influence of Calpain expression, levels of collagen I and III, and the ratio of collagen I to III in the pelvic floor tissue of the SUI (Stress Urinary Incontinence) rats, treated by the therapy of electro-acupuncture combined with intermediate frequency electrotherapy, to explain the mechanism of the treatment,and to provide objective evidence for the clinical application of this method. Methods：The 100 female SD rats were randomly divided into the blank group (group A), the model group (group B), the electro-acupuncture group (group C), the intermediate frequency electrotherapy group (group D), and the electro-acupuncture combined with intermediate frequency electrotherapy group (group E), 20 rats in each group. The models of SUI rats were set up by vaginal dilatation compression and bilateral ovariectomy. The maximum bladder capacity (MBC) of random 10 rats from all groups was tested before treatment, and seven days and fourteen days after treatement. The contents of Collagen I, Collagen III, and the changes of I/III ratio in pelvic floor tissues were determined by ELISA method.Results：The clinical symptoms of all groups, except group B, significantly improved; The MBC, the levels of Calpain Collagen I, Collagen III, and I/III ratio in group E were significantly higher than those in group C and group D (P<0.05). Conclusion：Electro-acupuncture combined with intermediate frequency electrotherapy can effectively increase the MBC, improve the symptoms of SUI rats, reduce Calpain expression in pelvic floor tissues, and increase the content of Collagen I, III and I/III ratio.

Electro-acupuncture;Intermediate frequency electrotherpy;Stress urinary incontinence(SUI);Modulated medium frequency pulse current;Calpain;Collagen

黑龙江省教育厅科学技术研究项目，编号：12541766

邢艳丽(1958-)，女，主任医师，主要从事脑卒中综合康复的规范化临床治疗。

△通讯作者：高潇(1983-)，男，主治医师，主要从事临床康复工作。

R245.97

A

1005-0779(2017)05-0070-05

2016-11-20