caspase抑制剂z-VAD-fmk对阿霉素损伤乳鼠心肌细胞calumenin、caspase-3、GRP78及GRP94表达的影响*

宝云龙， 王 羽， 吴 哲， 崔晓雪， 杜建军， 王伊林， 赵 明△

(1. 内蒙古通辽市医院， 2. 内蒙古民族大学， 通辽 028000)



caspase抑制剂z-VAD-fmk对阿霉素损伤乳鼠心肌细胞calumenin、caspase-3、GRP78及GRP94表达的影响*

宝云龙1， 王 羽2+， 吴 哲1， 崔晓雪2， 杜建军1， 王伊林2， 赵 明2△

(1. 内蒙古通辽市医院， 2. 内蒙古民族大学， 通辽 028000)

目的：研究细胞凋亡限速酶caspase广谱抑制剂z-VAD-fmk对阿霉素损伤心肌细胞calumenin、caspase-3、GRP78及GRP94表达的影响, 探讨心肌细胞网腔钙结合蛋白与内质网应激及心肌细胞凋亡是否存在相互调控关系。方法：原代培养乳鼠心肌细胞实验分为3组：对照组(正常细胞)、阿霉素组(3 mg/L阿霉素+心肌细胞)、Z-VAD-fmk组(3 mg/L阿霉素+0.1 μmol/L Z-VAD-fmk+心肌细胞)，每组细胞设3个复孔，分别处理后置37℃、CO2培养箱中培养24 h阿霉素组、z-VAD-fmk组。采用免疫组化方法检测培养乳鼠心室肌细胞α-SMA蛋白。采用Western blot技术检测各组心肌细胞Calumenin、内质网应激伴侣蛋白GRP78、GRP94及caspase-3表达。结果：与对照组相比较，阿霉素组心肌细胞calumenin表达明显减少(P<0.01)，GRP78 、GRP94及caspase-3表达增加(P<0.01)。与阿霉素组相比较，z-VAD-fmk组心肌细胞calumenin表达增加(P<0.01)，而GRP7，GRP94及caspase-3减少(P<0.01)。结论：caspase广谱抑制剂z-VAD-fmk增加阿霉素损伤心肌细胞calumenin表达进而缓解内质网应激。

阿霉素；内质网应激；网腔钙结合蛋白；乳鼠；z-VAD-fmk

阿霉素属蒽环类抗癌药物，具有抗瘤谱广、抗瘤活性强的特点，临床上广泛应用于多种恶性肿瘤治疗。但因对心肌的毒性作用，限制了这一高效抗肿瘤药物的临床应用，随其剂量的增加而导致不可逆

的心肌损伤，最终可发生扩张性心肌病及充血性心力衰竭[1]。关于阿霉素心肌病的发病机制目前尚未清楚，近年来认为与心肌细胞凋亡密切相关[2-4]。凋亡的产生机制复杂,近年发现内质网应激反应介导的细胞凋亡是一条新的细胞凋亡信号转导通路[5]。网腔钙结合蛋白(calumenin) 是一种位于哺乳动物心肌细胞内质网/肌浆网内属于CREC家族具有多个EF-hand 结构的钙离子(Ca2+)结合蛋白[6]，文献报道：calumenin缓解心肌细胞ERS并减少ERS介导的心肌细胞凋亡数量[7]。研究认为caspases 的激活是心肌细胞凋亡的一个关键现象，caspase是一类同源蛋白酶，以酶原或无活性的形式被合成，在体内低水平组成性表达，外部或内部的刺激引发caspase以瀑布形式激活，进而催化下游分子，产生作用。Caspase主要参与细胞凋亡的过程，在细胞凋亡过程中处于中心地位[8]。Caspase在细胞凋亡、活化及增殖中起到重要作用，其发挥作用受到多因素的调控。某些小分子与细胞作用后，直接抑制caspase的活性，称为caspase的抑制剂。广谱caspase抑制剂Z-VAD-fmk为其中的一种，可以明显抑制心肌细胞凋亡[9]。本实验拟研究Z-VAD-fmk对阿霉素损伤心肌细胞calumenin、caspase-3、GRP78及GRP94作用,讨论阿霉素损伤心肌细胞网腔钙结合蛋白与内质网应激及心肌细胞凋亡是否存在相互调控关系，进一步揭示阿霉素心肌病发病机制。

1 材料与方法

1.1 动物药品与仪器

(1)1～3 d,Balb/c新生乳鼠购置吉林大学基础医学院动物中心,许可证号：scxk(吉)2011-0004; (2)ɑ-SMA antibody (货号：BM0002)购自博士德公司，Calumenin antibody(货号：bs-6658R-A555)购于Bioss公司, GRP78 antibody(货号：PA1815)，GRP94 antibody(货号：PA1340)，caspase-3 antibody(货号：PB9188)购于Boster公司，内参抗体 β-actin(货号：wl01845)购于wanleibio公司。(3)阿霉素(深圳万东药业),Z-VAD-fmk(sigma)。

本研究表明基础肝脏疾病不同的HBV-ACLF患者临床特征和预后有所不同，WGO推荐的分类适用于中国HBV-ACLF患者。ACLF概念需要强调识别基础肝病，这有利于临床患者的管理和治疗。本研究属于单中心、回顾性研究，具有一定局限性；另外，WGO认为ACLF中急性打击导致的器官衰竭应涵盖肝内及肝外脏器，而本研究纳入患者均以肝脏功能衰竭为主要表现，未纳入单纯肝外脏器衰竭者。中国ACLF的概念将来是否要完全或者部分采用WGO-ACLF概念，还需要进一步深入研究。

《白皮书》通过采集并梳理全国范围内的12240户育儿家庭用户行为大数据与在线调查问卷，向社会勾勒出新生代年轻家庭在育儿方面的“众生相”，并囊括当下最热门的育儿话题，为更好地了解中国育儿家庭提供了有意义的参考。

1.3 免疫组织化学方法鉴定乳鼠培养心肌细胞

传统教育模式中，教师作为课堂主体，在新课改环境下，转换了教师和学生的地位，在小学数学课堂上，教师只是学生的引路人，帮助学生更好地吸收数学知识，培养数学能力。要激发学生学习数学的兴趣，需要不断完善教学方法。为了调动学生在课堂上的积极性，笔者通常在每节数学课的开始，会先给学生留三到五分钟时间自己熟悉本节课应学的内容，让没有预习的学生也能稍微热热身，或者讲解一些与本节课内容相关的简单又有趣的数学题。

1.4 实验设计

各组乳鼠培养心肌细胞进行免疫组化鉴定，0.1%TritonX-100孵育，3%过氧化氢孵育，血清室温封闭30 min，一抗ɑ-SMA(1∶1 000)孵育2 h，PBS洗3次，每次5 min，二抗孵育1 h，PBS洗3次，每次5 min，辣根酶标记; DAB显色5～10 min，显微镜下观察以掌握染色程度，PBS洗10 min，苏木素复染2 min，镜检。

构建问卷时，充分考虑社会距离对行为的影响。以情景1和11为例，社会距离对泰国留学生使用直接请求言语行为策略和我们想象的有所不同。照常理，社会距离越近，越容易实施直接请求言语行为，但调查结果显示，社会距离较近的反而更多使用间接请求策略，而社会距离较远的反而更多使用直接请求策略。深入探讨发现，在泰国高等社会地位主要有三级。一级：国王，二级：和尚，三级：长辈和老师，对这三级给予崇高敬意。因此即使对自己的祖父，社会距离亲近，依然惯用间接请求策略。

自从20世纪70年代能源危机以来，以丹麦为代表的许多西方国家开始进行生物质能源发电研究，垃圾、动物粪便、农业剩余物等都曾经被用来尝试发电。但是30多年的科学研究与实践证明了农作物秸秆直燃发电是一种最适宜的选择。

细胞培养于10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，置于37℃，5%CO2的培养箱内培养。隔天换液处理，接种密度为70%为宜，便于加药。细胞加药：对照组(心肌细胞)、阿霉素组(3 mg/L阿霉素+心肌细胞)、Z-VAD-fmk组(3 mg/L阿霉素+0.1 μmol/L Z-VAD-fmk+心肌细胞)Z-VAD-fmk药物浓度参考发表文献[10]，药物处理细胞24 h后收集细胞，用于后续实验。每组细胞设3个复孔。

1.2 乳鼠心肌细胞的分离与培养

1.5 Western blot检测各组心肌细胞Calumenin及caspase-3表达

2.2 各组心肌细胞Calumenin及caspase-3表达

1.6 Western blot检测各组心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78、GRP94表达

乳鼠培养心肌细胞经免疫组化实验，检测出心肌细胞特有的ɑ-SMA蛋白，培养细胞为ɑ-SMA蛋白阳性染色，确定为心室肌细胞(图1，见彩图页Ⅰ)。

1.7 统计学处理

将乳鼠心脏放入培养皿中，用PBS反复清洗。将清洗后的心脏组织剪碎至1～3 mm3小块。加入0.1%Ⅱ型胶原酶以及0.1%胰蛋白酶混合液，37℃消化25 min。消化好后将其移入15 ml离心管1 500 r/min离心7 min去上清。用PBS重悬沉淀，用吸管反复吹打后1 000 r/min离心5 min，用培养基重悬细胞，过200目筛网去除大块组织。PBS清洗细胞两次，1 000 r/min离心10 min，去上清，留沉淀。加入1 ml的培养基重悬细胞，进行细胞计数后放置到培养板中。成纤维细胞贴壁较快，2 h差速贴壁法可去除大量的成纤维细胞，上清悬液中为较纯的心肌细胞。细胞放置在培养板后24 h不用动，随后每两天换1次液。培养细胞至密度为90%左右，PBS清洗2次。按实验内容将细胞接种于6孔板中，细胞浓度为5×104cells/ml，置于37℃，5%CO2的培养箱内培养过夜。24 h可进行转染，细胞密度一般在70%为宜。

2 结果

2.1 各组乳鼠培养心肌细胞免疫组化

绿色环保是近年来苏印总厂发展的一个重要命题，从源头削减，中间控制到末端处理，每一步，其都格外重视。据介绍，公司使用先进的环保材料，积极推行无水胶印等先进技术，在自身生产过程中减少VOCs等有害物质的排放。此外，其于四年前专门成立了清洁生产治理委员会，投资配备了处理废气、废水、固废物等的环保装备，建立了清洁环保管理体系，以保证每一指标都可以达到标准，甚而要做得更好。

实验方法同实验1.5，检测各组乳鼠心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78、GRP94表达，明确阿霉素损伤心肌细胞抑制凋亡限速酶caspase-3表达是否引起GRP78、GRP94表达变化，每组重复3次。

各组心肌细胞经上述实验处理后，提取细胞总蛋白质并将蛋白质定量。定量后的蛋白质按一定量进行SDS-PAGE。根据定量的结果，每孔加入15 μg蛋白质。电泳后，取出凝胶，15 V转膜1 h，将膜取下，用5%的脱脂奶粉于室温摇动封闭1 h，加入针对目的蛋白的一抗(Calumenin为1∶1 000；caspase-3为1∶1 000)，室温作用1 h后，TBST清洗4次，加入二抗作用1 h，用ECL显色液进行显影，每组重复3次。检测各组心肌细胞Calumenin、总caspase-3表达，明确阿霉素损伤心肌细胞抑制凋亡限速酶caspase-3表达是否引起心肌细胞Calumenin表达变化。

与对照组心肌细胞caspase-3相比较，阿霉素组心肌细胞caspase-3表达增加(P<0.01)，而无论与对照组还是阿霉素组心肌细胞比较，Z-VAD-fmk组心肌细胞caspase-3表达明显降低(P<0.01)，这证明Z-VAD-fmk抑制caspase-3作用有效；与对照组心肌细胞Calumenin相比较，阿霉素组心肌细胞Calumenin表达减少(P<0.01)，而与阿霉素组心肌细胞比较，Z-VAD-fmk组心肌细胞Calumenin表达增加(P<0.01, 图2，表1)。

Fig. 2 The expressions of Calumenin and caspase-3 in cultured myocytes A: Control group; B: Adriamycin group; C: Z-VAD-fmk group

GroupCalumeninCaspase-3Control762±106853±78Adriamycin269±54**1806±195**Z-VAD-rmk539±83##984±121##

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsadriamycin group

2.3 各组心肌细胞内质网应激伴侣蛋白GRP78、GRP94表达

试验地选择在贵州省毕节市黔西县绿化乡小海子村丫口组谢与军农户的承包地上，土质黄壤，地势平坦，肥力中等均匀，前作玉米，东经106°03'81"，北纬 26°58'27"，海拔 1 252.6m。

与对照组心肌细胞GRP78相比较，阿霉素组心肌细胞GRP78表达增加(P<0.01)，与阿霉素组心肌细胞比较，Z-VAD-fmk组心肌细胞GRP78表达降低(P<0.01)； 与对照组心肌细胞GRP94相比较，阿霉素组心肌细胞GRP94表达增加(P<0.01)，与阿霉素组心肌细胞比较，Z-VAD-fmk组心肌细胞GRP94表达降低(P<0.01, 图3，表2)。

3 讨论

Caspase是通过靠近天冬氨酸残基位置的切割效应, 进而导致caspase 家族成员以类似于酶原激活的方式相互激活, 并产生放大效应。 Caspase-3 属于在级联下游操作底物酶切的重要效性caspase, 是目前已知与凋亡关系最密切的 caspase 家族成员之一，在凋亡过程中起到了至关重要的作用[11]。本研究通过在细胞中加入z-VAD-fmk检测casapse3的表达情况，发现casapse3表达下降，说明z-VAD-fmk有效的抑制casapse3的表达，同时检测calumenin蛋白发现其表达升高，提示z-VAD-fmk加入细胞后，可以缓解凋亡的发生。

Fig. 3 The expressions of GRP78 and GRP94 in cultured myocytes A: Control group; B: Adriamycin group; C: Z-VAD-fmk group

GroupGRP78GRP94Control1548±1651014±113Adriamycin3260±298**1560±137**Z-VAD-rmk2266±191##1123±129##

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsadriamycin group

内质网稳态失衡时，内质网正确折叠蛋白质功能异常，可能致误折叠蛋白在内质网内异常聚集及内质网应激性蛋白分泌增加，并且识别错误折叠蛋白，并通过蛋白酶体将其降解，上述一系列反应过程即内质网应激反应(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS发生后，内质网通过上调分子伴侣蛋白GRP78及GRP94 表达、抑制蛋白质合成、加速错误折叠和未折叠蛋白质降解等方式缓解ERS。然而持续或较严重的ERS 则通过下列PERK→P-PERK→eIF2a→ATF4→CHOP/caspase12→caspase9→caspase3/ATF6→CHOP等信号通路触发凋亡信号，诱导CHOP、caspase-3、JNK 等促凋亡因子的表达及活化，导致ERS细胞凋亡[12]。78 kDa-糖调节蛋白(78-kDa glucose-regulated protein, GRP78)和94 KDa-糖调节蛋白(94-kDa glucose-regulated protein, GRP94)属于热休克蛋白(HSP70) 家族, 也称免疫球蛋白重链结合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein, BiP),是内质网分子伴侣蛋白, 通过与内质网应激元件 PKR、IRE1 以及 ATF6 的结合抑制 ERS 的激活, 在未折叠蛋白反应中发挥主要调控作用, 生理情况下, GRP78 在基础水平表达, 主要功能是作为分子伴侣参与新生多肽链的折叠 、装配和转运, GRP78 的诱导广泛被认为是 ERS 的标志性分子[13]。本研究结果证明，z-VAD-fmk可缓解因阿霉素导致的GRP78和GRP94的高表达，进而缓解了内质网应激。提示z-VAD-fmk通过抑制内质网应激进而影响了凋亡的发生。

本团队在前期研究中发现：calumenin对阿霉素诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用[4],而且发现阿霉素损伤可能诱发ERS，并通过ERS凋亡信号通路PERK→P-PERK→eIF2a→ATF4→CHOP/IRE1→CHOP引起心肌细胞凋亡[14]。本研究应用caspase广谱抑制剂z-VAD-fmk抑制阿霉素损伤心肌细胞caspase表达，观察到z-VAD-fmk可以增加阿霉素损伤心肌细胞calumenin表达进而缓解内质网应激，实验结果进一步证实了心肌细胞calumenin表达减少可以加重阿霉素损伤并引发内质网应激导致心肌细胞凋亡，为阿霉素心肌损伤发病机制提供基础理论。

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Effects of caspase inhibitor z-VAD-fmk on the expressions of calumenin,caspase-3, GRP78 and GRP94 in adriamycin-injured cardiomyocytes

BAO Yun-long1, Wang Yu2+, WU Zhe1, CUI Xiao-xue2, DU Jian-jun1, WANG Yi-lin2, ZHAO Ming2△

(1. The Inner-Mongolia Tongliao City Hospital, 2. The Inner-Mongolia National University, Tongliao 028000, China)

Objective: To study the effects of Caspase broad spectrum inhibitor Z-VAD-FMK on the expressions of calumenin,caspase-3,GRP78 and GRP94 in adriamycin-injured cardiomyocytes and to discuss whether there is a regulation relationship between calumenin and endoplasmic reticulum stress and myocardial apoptosis. Methods: The primary cultured suckling mouse myocardium were randomly divided into control group (cardiomyocyte), adriamycin group (3 mg/L adriamycin+cardiomyocyte) and z-VAD-fm group (3 mg/L adriamycin+0.1 μmol/L Z-VAD-fmk + cardiomyocyte), each group of cardiomyocytes were cultured in CO2incubator at 37℃ for 24 h (n=3). The expression of α-SMA protein in ventricular myocytes was detected by immunohistochemical method. The expressions of calumenin, GRP78, GRP94 and Caspase-3 in the myocardial cells were detected by Western blot. Results: Compared with the control group, the expression of calumenin in adriamycin induced myocardial cells was significantly decreased (P<0.01), while the expressions of GRP78, GRP94 and Caspase-3 expression were increased (P<0.01). Compared with adriamycin group, the expression of calumenin in z-VAD-fm group was increased (P<0.01), while the expressions of GRP78, GRP94 and caspase-3 were decreased (P<0.01). Conclusion: The caspase inhibitor z-VAD-fmk inhibited the expression of caspase and increased the expression of calumenin in adriamycin induced myocardial cells, and thus alleviated the endoplasmic reticulum stress.

adriamycin; endoplasmic reticulum stress; calumenin; suckling mouse; z-VAD-fmk

内蒙古自然科学基金项目(2015MS08150)

2015-11-24

2016-11-22

R331.3；R-332

A

1000-6834(2017)03-222-04

12.12047/j.cjap.5384.2017.055

△【通讯作者】Tel: 13474859991； E-mail: langzhe73@163.com;+: 共同第一作者