PI3K/Akt信号通路在白藜芦醇抗大鼠缺血/再灌注性心律失常中的作用及机制*

宋 娟， 王 佳， 李宝红， 王 东， 孟董超， 卢彦珍△

(1. 长治医学院病理生理学教研室； 2. 免疫学教研室； 3. 教改班2013级， 山西 长治 046000)



PI3K/Akt信号通路在白藜芦醇抗大鼠缺血/再灌注性心律失常中的作用及机制*

宋 娟1， 王 佳2， 李宝红1， 王 东3， 孟董超3， 卢彦珍1△

(1. 长治医学院病理生理学教研室； 2. 免疫学教研室； 3. 教改班2013级， 山西 长治 046000)

目的：探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路在白藜芦醇抗缺血/再灌注性心律失常中的作用及机制。方法：48只健康雄性SD大鼠，取心电图正常者随机分为4组(n=10)：假手术(SC组)组、缺血/再灌注(I/R组)组、白藜芦醇处理(Res处理组)组、PI3K抑制剂LY294002(LY294002组)组。建立大鼠在体心肌缺血/再灌注模型，观察各组心律失常的发生情况及左室血流动力学变化，Western blot法测定心肌组织中蛋白激酶B(Akt)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、缝隙连接蛋白43(Cx43)蛋白表达水平，以RT-PCR法从转录水平检测Cx43的表达水平。结果：与I/R组相比，Res处理组心律失常的发生率(心律失常评分)明显降低、左室舒缩功能明显升高，同时心肌Akt、Cx43蛋白表达及Cx43mRNA水平也明显升高；使用PI3K抑制剂LY294002后，心肌Akt、Cx43蛋白表达及Cx43mRNA水平下降的同时心律失常的发生率明显升高、左室舒缩功能明显降低。结论：白藜芦醇的抗再灌注性心律失常作用可能是通过激活PI3K/Akt信号通路，改变Cx43活性及分布实现的。

白藜芦醇；再灌注性心律失常；PI3K/Akt信号转导通路；缝隙连接蛋白43；大鼠

缺血/再灌注性心律失常(ischemia/reperfusion

arrhythmia，I/RA)是缺血性心脏病采用溶栓或冠状动脉介入治疗术后血管再通所致的常见临床现象，其发生率高，也是临床猝死的主要原因之一。如何有效减轻和防治缺血RA成为目前缺血性心脏病及临床心脏病介入治疗的研究热点和一大难题。研究表明[1]缝隙连接蛋白43(connexin 43，Cx43)与心律失常的发生关系密切，缺血再灌注可致心肌Cx43表达减少及分布异常，使细胞间通讯和电传导耦联能力改变引起心脏电活动异常诱发心律失常[2, 3]，采用基因工程技术提高心肌缺血梗死边界Cx43表达，能够明显降低心律失常的发生[4]。白藜芦醇(resveratrol，Res)是富含于葡萄皮和红酒中的一种多酚化合物，拥有多种心血管保护作用。最近研究发现，Res可以有效减少缺血及再灌注后心律失常事件的发生[5, 6]，且是通过上调心肌Cx43的表达发挥作用[7]。但Res是通过何种信号传递机制调节心肌Cx43从而发挥抗缺血及再灌注后心律失常发生的未见报道。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B (phosphatidyl-inositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)信号通路广泛存在于细胞中，是细胞内重要的生存通路，Akt的活化可直接导致Cx43磷酸化[8]。本研究旨在通过抑制PI3K/Akt信号转导通路探讨Cx43在Res抗RA中的作用及机制，以期为临床应用Res治疗RA提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂

Res购自大赛璐药物手性技术上海有限公司； PI3K抑制剂LY294002、碱性磷酸酶标记的IgG二抗和β-actin单克隆抗体购自Sigma公司；Akt、p-Akt Thr308、Cx43多克隆抗体购自Santa Cruz公司；RT-PCR检测试剂盒购自Takara公司；

1.2 造模与分组

选择体重(220±30)g健康雄性SD大鼠48只，腹腔注射20%的乌拉坦(1 g/kg)麻醉后仰位固定，以针形电极插于四肢皮下观察记录肢体Ⅱ导联心电图。作颈部正中切口，分离右侧颈总动脉及气管，气管插管后连接小动物呼吸机，设定潮气量为1.0 ml/100 g体重，呼吸频率45～60 counts/min，呼吸比为1.5∶1。沿胸骨左缘第3～4肋间隙切口逐层打开胸腔，剪开心包、暴露心脏，在左冠脉前降支(LAD)距左心耳下缘2 mm处绕血管穿线备用。稳定后，取心电图正常者随机分为4组(n=10)：(1)假手术(sham control，SC)组，穿线不结扎，旷置60 min；(2)缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)组，结扎LAD 心肌缺血20 min，再灌注40 min。以结扎线以下心肌组织变色，心电图ST段明显抬高为心肌缺血标志，放松结扎线后ST段下降1/2以上为模型成功；(3)白藜芦醇处理(Res)组，经舌静脉于结扎LAD前15 min 及再灌注前1 min注射白藜芦醇1 ml/kg；(4)PI3K抑制剂LY294002(LY294002组)组，于再灌注前15 min经尾静脉注射PI3K抑制剂LY294002 (0.3 mg/kg)，余同Res组。

1.3 心电图及心律失常的评分

大鼠肢体Ⅱ导联心电图变化采用BL-420 生物信号处理系统记录，全程记录缺血再灌注期间的室性早搏(premature ventricular beats，PVB)数、室性心动过速(ventricular tachycardia，VT)持续时间(VTt)和心室纤颤(ventricular fibrillation，VF)持续时间(VFt)。按照Lambeth 会议标准，评分则以Curtis 等[9]的评分规则进行： 0分，无心律失常；1分，偶发性PVB； 2分，频发性PVB； 3分，偶发性VT； 4分，频发性VT或偶发性VF； 5分，频发性VF或死亡。偶发性PVB 指1min内发生3次以下的PVB；频发性PVB指1 min内发生3次或以上的PVB；偶发性VT指1 min内发生3次以下的VT；频发性VT指1 min内发生3次或以上的VT；偶发性VF指1 min内发生3次以下的VF；频发性VF指1 min内发生3次或以上的VF。

1.4 缺血/再灌注大鼠左室功能测定

除SC组旷置60 min外其余3组再灌注40 min，从右颈总动脉插入PE-50软质塑料导管至左心室，平稳后应用BL-420生物信号处理系统记录左心室压力曲线，记录左心室内压峰值(left ventricular systolic pressure ，LVSP)、左心室收缩及舒张最大压力变化速率(maximal rise and fall velocity of left ventricular pressure，±dp/dt max)。

1.5 心肌组织Akt和Cx43蛋白表达的检测

取液氮冻存100 mg心肌组织，加组织蛋白裂解液匀浆、离心、收集上清液得心肌组织提取液。用Western blot方法检测各组心肌组织中Akt和Cx43蛋白表达的变化。具体方法：用BCA法测定蛋白浓度后，以B-actin为内参，将处理好的蛋白质以每个样品的总蛋白为20 μg上样，进行SDS-PAGE分离，电泳结束后转印至硝酸纤维素膜上。脱脂奶粉封闭，加Akt、p-Akt Thr308和Cx43(1：1000稀释)一抗4℃孵育过夜，加入二抗，37℃孵育1 h，漂洗后用化学发光法检测Akt、p-Akt Thr308和Cx43蛋白的表达水平。

1.6 心肌组织中Cx43mRNA相对表达量的检测

取冻存心肌采用Trizol法提取组织总RNA，测OD 值、浓度及鉴定RNA 完整性后，按照逆转录试剂盒(Takara公司)说明书合成cDNA。Cx43引物参照基因库基因序列设计，Cx43上游引物5′- GAAGGCGTGAGGAAAGTA -3′，下游引物5′- GTGGAAATGGCAAAGACA -3′。实时定量PCR反应在25 μl反应体积中进行(SYBER Green 12.5 μl，模板1 μl ， 10 μmol/L上下游引物混合物0.5 μl，水补足)。反应条件为：95℃预变性5 min 后进入PCR循环：95℃变性30 s，58℃退火 30 s，延伸1 min，共40个循环。以β-actin为内参基因，使用2-ΔΔCt法定量相对mRNA转录水平，相对表达量由PCR扩增产量与内参β-actin相比得出。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 LY294002对心律失常的影响

SC组在观察期间内未发生VT和VF，仅偶尔出现PVB；结扎LAD造成大鼠心肌缺血20 min后再灌注40 min，连续记录Ⅱ导联心电图可见缺血期间出现PVB、VT和VF等心律失常，解除结扎再灌尤其是再灌注即刻至15 min内，出现较为严重的VT和VF；缺血及再灌注前用Res处理大鼠在心肌缺血再灌注期间也出现各种室性心律失常(ventricular arrhythmias，VA)，但与I/R组相比，其持续时间明显缩短，心律失常评分也显著降低(P<0.01)，而使用PI3K抑制剂LY294002后，缺血再灌注期间均出现严重的VT和VF，且持续时间长，心律失常的评分明显升高(P<0.01，表1)。

Tab. 1 Effect of resveratrol and LY294002 on reperfusion induced arrhythmias ±s， n=10)

SC： Sham control； I/R： Ischemic/reperfusion； Res： Resveratrol treatment； LY294002： PI3K inhibitor LY294002； PVB： Premature ventricular beats； VT： Ventricular tachycardia； VF： Ventricular fibrillation

**P<0.01vsSC group；##P<0.01vsI/R group；△△P<0.01vsRes group

2.2 LY294002对心脏功能的影响

与SC组相比， I/R组缺血20 min再灌注40 min后反应心脏收缩、舒张功能的三项重要指标LVSP、±dp/dt max均显著降低(P<0.01)，表明I/R使大鼠左室收缩舒张功能严重受损；与I/R组比较，Res组大鼠心功能指标LVSP、±dp/dt max明显改善(P<0.05，P<0.01)，表明Res对I/R心脏功能有明显的保护作用。而使用PI3K抑制剂LY294002后，心脏功能的三项重要指标均降低(P<0.01)，说明随着PI3K/Akt信号转导通路被抑制，心脏功能受损(表2)。

2.3 白藜芦醇及抑制剂LY294002对心肌组织中Akt、Cx43蛋白表达的影响

Western blot方法检测结果显示SC组大鼠心肌组织中Akt(1.0±0.03)和Cx43蛋白(1.0±0.11)有不同程度的表达，I/R组p-Akt和Cx43蛋白水平明显低于SC组(0.3±0.07vs1.0±0.03；0.7±0.06vs1.0±0.11，P<0.01)， 应用Res处理后p-Akt和Cx43的表达水平明显升高(0.8±0.12vs0.3±0.07；1.2±0.13vs0.7±0.06，P<0.01)，而使用PI3K抑制剂LY294002后p-Akt和Cx43明显降低(0.1±0.02vs0.8±0.12；0.6±0.03vs1.2±0.13，P<0.01，图1)。

GroupLVSP(kPa) dp/dtmax(kPa/s)-dp/dtmax(kPa/s)SC14.62±3.23824.0±46.8610.0±32.6I/R6.98±1.83**431.0±27.4**365.0±41.5**Res12.22±2.15**##682.0±32.3**##458.0±37.6**#LY2940027.14±1.63**△△452.0±29.8**△△351.0±39.4**△△

SC： Sham control； I/R： Ischemic/reperfusion； Res： Resveratrol treatment； LY294002： PI3K inhibitor LY294002； LVSP： Left ventricular systolic pressure； dp/dt max： Maximal rise velocity of left ventricular pressure； -dp/dt max： Maximal fall velocity of left ventricular pressure

**P<0.01vsSC group；#P<0.05，##P<0.01vsI/R group；△△P<0.01vsRes group

2.4 白藜芦醇及抑制剂LY294002对心肌组织中Cx43 mRNA表达的影响

经20 min缺血、40 min再灌注后，与SC组相比，I/R组心肌Cx43 mRNA水平明显降低(0.6±0.03vs1.0±0.12，P<0.01)，经Res处理后Cx43 mRNA水平明显升高(1.0±0.15vs0.6±0.03，P<0.01)，而应用PI3K抑制剂LY294002后心肌组织中Cx43水平显著降低(0.5±0.13vs1.0±0.15，P<0.01，图2)。

Fig. 1 Protein expression level of Akt and Cx43 SC： Sham control； I/R： Ischemic/reperfusion； Res： Resveratrol treatment； LY294002： PI3K inhibitor LY294002； Akt： Protein kinase B； Cx43： Connexin43**P<0.01vsSC group；##P<0.01vsI/R group；△△P<0.01vsRes group

Fig. 2 mRNA level of Cx43 in rat myocardium with I/R SC： Sham control； I/R： Ischemic/reperfusion； Res： Resveratrol treatment； LY294002： PI3K inhibitor LY294002； Cx43： Connexin 43**P<0.01vsSC group；##P<0.01vsI/R group；△△P<0.01vsRes group

3 讨论

对缺血性心脏病最根本的治疗是血管再通和恢复血流，这一原则已得到普遍的认识。但随着血管再通和血流恢复，尤其在复灌后的15 min内，往往发生严重的RA，其中VT、VF极易造成心源性休克、心脏停搏、心源性猝死等威胁生命的严重后果，故有效减轻和防治RA意义重大。大量研究证实Cx43的含量、分布及功能的异常在心律失常的发生中具有重要作用[1-3]。心肌缺血后心肌细胞Cx43表达降低，室性心律失常的发生率明显增加[10]。苏德淳等[11]用在体大鼠心肌局部缺血模型，证实持续缺血能够降低心肌总Cx43及磷酸化Cx43水平，同时各种心律失常的发生率明显增加，推测心肌缺血造成Cx43减少，进而导致心肌电失耦联发生室性心律失常。Cx43基因缺陷的小鼠急性心肌缺血时心肌间电传导明显减慢且室性心律失常明显增加[12, 13]；采用基因工程技术提高心肌缺血梗死边界Cx43表达，能够明显降低心律失常的发生[4]。上调Cx43的表达、促进其磷酸化可减少再灌注心律失常的产生[7]。Res是从植物中提取的多酚类化合物，流行病学调查和越来越多的研究证明Res对心血管有明显的保护作用，其保护作用主要体现在改善心律失常、抑制血小板聚集、减轻缺血/再灌注损伤等。王光宇[7]等在大鼠心肌梗死模型上证明Res降低大鼠心肌梗死后心律失常的发生与提高心肌Cx43的表达及改善分布密切相关。本实验给I/R大鼠静脉注射白藜芦醇后，发现与单纯缺血/再灌注组相比Cx43无论从蛋白表达水平还是从mRNA转录水平均显著升高，其心功能明显恢复、心律失常发生率显著下降，与王光宇[7]等在心肌梗死模型上的研究结果一致，表明Res的抗心律失常作用与其上调心肌Cx43 的表达有关。但Res是通过何种信号传递机制调节心肌Cx43从而发挥抗缺血及再灌注后心律失常发生的？

PI3K/Akt通路是细胞内重要的信号转导通路，参与缺血预适应和缺血后适应等多种干预措施的心肌保护作用。有研究表明Akt的活化可直接导致Cx43增加及磷酸化[8]。苏德淳等[11]不仅证实持续缺血时各种心律失常的发生率明显增加是由于降低了心肌总Cx43及磷酸化Cx43水平，而且他们发现缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)强大的抗心律失常作用是由于其明显增加了心肌总Cx43含量及诱导磷酸化Cx43表达，进而开放缝隙连接实现的。Res是否通过PI3K/Akt信号通路提高缺血/再灌注心肌的总Cx43及磷酸化Cx43产生抗心律失常作用尚未有研究。本实验用Western blot和RT-PCR技术检测心肌组织中Akt和Cx43，发现与I/R组相比，接受Res治疗组大鼠心肌p-Akt的表达水平明显升高，其心肌组织中Cx43蛋白及mRNA的表达水平显示同步增加，同时心律失常发生率明显降低、心功能明显改善，表明Res可以通过PI3K/Akt信号通路上调I/R大鼠心肌的Cx43蛋白表达量及mRNA水平产生抗心律失常作用；而应用PI3K特异性抑制剂LY294002，特异抑制AktThr-308位点磷酸化后，心肌中Cx43蛋白表达水平与mRNA表达水平明显降低，相应地心律失常发生率显著升高而心功能明显降低，表明PI3K/Akt抑制剂LY294002抵消了白藜芦醇引起的Akt-Cx43介导的心脏保护作用。结合文献我们认为Res可能通过激活PI3K/Akt信号通路，使肌醇环上的3位羟基磷酸化，生成使Akt激活的第二信使三磷酸磷脂酰肌醇。激活的Akt可上调Cx43的表达及活性从而减轻缝隙连接的功能损害或增加缝隙连接面积[14]发挥强大的抗再灌注性心律失常作用。

目前临床上治疗缺血/再灌注心律失常主要以Ⅲ类抗心律失常药物为主，但其远期疗效不理想，而且副作用很明显。因此寻找更加安全有效、可供长期应用的抗心律失常药物就变得尤为重要，特别是天然的、不良反应小的药物。白藜芦醇是一种天然的植物抗毒素，广泛存在于葡萄皮和葡萄酒中。希冀通过对白藜芦醇抗心律失常作用机制的研究，使科研工作者和临床医生对白藜芦醇有更深层次的了解，为其治疗缺血及再灌注性心律失常进一步提供理论依据。

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A study on anti-arrhythmia mechanisms of resveratrol on ischemia/reperfusion in rats by regulating PI3K/Akt signaling pathway

SONG Juan1， WANG Jia2， LI Bao-hong1， WANG Dong3， MENG Dong-chao3， LU Yan-zhen1△

(1. Department of Pathophysiology， 2. Department of Immunology， 3. Department of Reform of Education and Teaching Class of 2013 year，Changzhi Medical College, Changzhi 046000, China)

Objective: To investigate whether the phosphatidyl-inositol-3-kinase/protein kinase B(PI3K/Akt)pathway is involved in anti-arrhythmia of resveratrol on ischemia/reperfusion in rat hearts. Methods: Forty male rats of normal ECG were randomly divided into 4 groups(n=10): sham control (SC) group, ischemic/reperfusion (I/R) group, resveratrol (Res) group, PI3K inhibitor LY294002 (LY294002) group. The rat myocardial I/R injury model was established in vivo．The arrhythmia and left ventricular functional parameters including left ventricular pressure (LVP), left ventricular systolic pressure (LVSP) and its derivate (±dp/dtmax) were measured; the protein levels of total Akt, phosphorylated Akt and connexin 43 (Cx43) were measured by Western blot; the mRNA level of Cx43 was detected by Real-time PCR. Results: The phosphorylated levels of Akt and myocardial Cx43 were significantly enhanced in Res group as compared with I/R group(P<0.01); whereas the incidence rate of induced ventricular reperfusion arrhythmias was significantly lower, the left ventricular function was evidently enhanced. After addition of PI3K inhibitor LY294002, the protein and mRNA levels of Akt and Cx43 were decreased in LY294002 group, while the incidence rate of reperfusion arrhythmias was significantly higher and the left ventricular function were evidently damaged compared with Res group(P<0.01). Conclusion: Resveratrol could prevent the occurrence of reperfusion arrhythmias by increasing the content and activity of myocardial Cx43 through the PI3K/Akt signaling pathway.

resveratrol； reperfusion arrhythmia； phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B signaling pathway； Connexin43； Rat

山西省2013年国家级大学生创新创业训练资助项目(2013083)；长治医学院科技启动基金资助项目(QDZ201520)；长治医学院大学生创新创业训练计划项目(D2016001)

2016-11-04

2017-01-23

R541.7

A

1000-6834(2017)03-239-05

10.12047/j.cjap.5516.2017.059

△【通讯作者】Tel: 0355-3151441； E-mail: yzlu1957@163.com