苯并芘和4-溴联苯醚联合暴露对大鼠卵巢功能的影响及机制探讨

邓玉洁，刘慧，罗友红，史文杰，庞伟毅

(桂林医学院,广西桂林 541004)

·基础研究·

苯并芘和4-溴联苯醚联合暴露对大鼠卵巢功能的影响及机制探讨

邓玉洁，刘慧，罗友红，史文杰，庞伟毅

(桂林医学院,广西桂林 541004)

目的 观察苯并芘和4-溴联苯醚(BDE-3)单独及联合暴露对雌性大鼠卵巢功能的影响，并探讨其可能的损伤机制。方法 将60只大鼠随机分为4组，于动情期A、B、C、组分别给予溶于玉米油的苯并芘、BDE-3、苯并芘联合BDE-3 5 mg/(kg·d)等容灌胃法染毒暴露，D组给予玉米油5 mg/(kg·d)，连续灌胃28 d。于动情间期眼球取血，脱椎处死并获取卵巢组织。采用ELISA 法检测血清孕酮，分别采用荧光定量PCR、Western blot法检测卵巢组织中的芳香烃受体(AhR)mRNA、细胞色素P450家族成员1A1(CYP1A1)蛋白。结果 A、B、C组血清孕酮水平及卵巢组织AhR mRNA、CYP1A1蛋白相对表达量均较D组增高，且C组各指标均高于A、B组(P均<0.05)；A、B组比较，差异无统计学意义。结论 苯并芘和BDE-3暴露对卵巢功能产生损伤效应，且联合暴露可产生协同作用；其损伤机制可能是通过AhR调控CYP1A1表达，从而增强对卵巢组织的毒性效应。

苯并芘；4-溴联苯醚；孕酮；芳香烃受体；细胞色素P450；大鼠

苯并芘是多环芳烃类(PAHs)中具有典型代表性的一种环境污染物，可刺激芳香烃受体(AhR)使其从细胞质转入细胞核，与芳香族化合物受体核转运蛋白(ARNT)结合并激活DNA上特定基因，如细胞色素P450家族成员1A1(CYP1A1)等，使DNA构象发生改变，引起相应靶基因的表达异常，从而对细胞产生毒性效应[1,2]。多溴联苯醚(PBDEs)是公认的持久性有机物污染物，4-溴联苯醚(BDE-3)是PBDEs脱溴最终降解的产物之一，具有生殖毒性、胚胎毒性、神经发育毒性以及内分泌干扰效应[3～5]。由于PAHs和PBDEs共存于大气、水体和土壤环境中，毒效应谱有较大重叠，易在生物体内蓄积，影响人类健康。因此，研究二者的联合作用具有重要意义。2015年11月～2016年6月，我们观察了苯并芘和BDE-3单独及联合暴露前后雌性大鼠血清孕酮水平变化，探讨其对卵巢功能的影响及其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康雌性SD大鼠60只，体质量(180±20)g，8周龄，购自桂林医学院实验动物中心，合格证号SCXK桂2007-0001，饲养于桂林医学院公共卫生学院实验中心。

1.1.2 主要试剂 玉米油(Acros公司)，苯并芘、二甲基亚砜(DMSO)、BDE-3(Sigma公司)；大鼠孕酮试剂盒(北京华英技术研究所)，Allprep组织/细胞RNA/DNA/Protein 分提试剂盒(北京艾德莱生物科技有限公司)；Fast Quant RT Kit、SuperReal PreMix Plus(北京天根生化科技有限公司)，引物由苏州泓迅生物科技有限公司合成；蛋白质定量试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)，兔抗鼠CYP1A1多克隆抗体(Millipore公司)，兔抗鼠β-actin多克隆抗体(Novusbio公司)。

1.1.3 主要仪器 微量核酸蛋白测定仪(Thermo公司)，实时荧光定量PCR仪(ABI公司)，全波长酶标仪(Thermo公司)，Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统(Protein Simple公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组与染毒处理 将大鼠随机分为4组，每组15只。于动情期A、B、C、组分别给予溶于玉米油的苯并芘、BDE-3、苯并芘联合BDE-3 5 mg/(kg·d)等容灌胃法染毒暴露，D组给予玉米油5 mg/(kg·d)，连续灌胃28 d。染毒结束后，于动情间期眼球取血，脱椎处死并获取卵巢组织。

1.2.2 血清孕酮检测 将全血以3 000 r/min离心5 min，取上层血清，用ELISA法检测血清孕酮。

1.2.3 卵巢组织AhR mRNA检测 采用荧光定量PCR法。采用Allprep剂盒提取卵巢组织的总RNA，按Fast Quant RT Kit合成cDNA，再用SuperReal PreMix Plus以cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增。AhR上游引物5′-GGCCAAGAGCTTCTTTGATG-3′，下游引物5′-TGCCAGTCTCTGATTTGTGC-3′，产物长度93 bp；β-actin上游引物5′-CTACAATGAGCTGCGTGTG-3′，下游引物5′-TGGGGTGTTGAAGGTCTC-3′，产物长度121 bp。反应体系：2×SuperReal PreMix Plus 12.5 μL，正反向引物各0.75 μL，cDNA模板1 μL，50×ROX Reference Dye 0.05 μL，RNase-free ddH2O 9.95 μL。反应条件：95 ℃预变性15 min； 95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环。PCR实验数据采用相对定量，以2-ΔΔCt法计算。

1.2.4 卵巢组织CYP1A1蛋白检测 采用Western blot法。用Allprep试剂盒提取卵巢组织的蛋白并溶于1% SDS溶液中，按BCA法测定蛋白浓度。按Wes配套试剂盒操作步骤制备样品(终浓度为0.2 μg/μL)，再按说明将样品、生物素、封闭液、一抗、HRP标记的二抗及化学发光液抗体等试剂加入上样板，室温离心5 min(2 500 r/min)后上机进行全自动蛋白质印迹定量分析。Compass软件将采集的荧光信号转换为蛋白分子量数据及相应的表达图谱，以样本蛋白与内参蛋白的峰值面积比值表示该蛋白的相对表达量。

2 结果

各组大鼠血清孕酮水平及卵巢组织中AhR mRNA、CYP1A1蛋白相对表达量比较。见表1。

表1各组大鼠血清孕酮水平及卵巢组织AhR mRNA、 CYP1A1蛋白相对表达量比较

注：与D组比较，*P<0.05；与A组比较，#P<0.05；与B组比较，△P<0.05。

3 讨论

大量研究[6～8]显示，PAHs和PBDEs已成为多种肿瘤的危险因素，与乳腺癌、卵巢癌等的发生密切相关。孕酮由卵巢和肾上腺产生，在应激反应和下丘脑-垂体-肾上腺/性腺轴的调节方面具有重要作用。研究显示，环境内分泌干扰物具有非单调剂量-效应性，表现为低剂量促进而高剂量抑制。研究发现，将小鼠出生前暴露于己烯雌酚(DES) 中，DES对前列腺发育产生低剂量增殖、高剂量抑制的倒U形剂量-效应关系。Tian等[9]研究发现,苯并芘染毒第3天栉孔扇贝孕酮水平下降，而在第10天孕酮水平上升。表明苯并芘严重干扰了孕酮的正常波动，导致卵巢功能障碍。本研究结果显示，苯并芘和BDE-3暴露大鼠血清孕酮水平增加，可能是低剂量暴露呈现的激活效应。

AhR是一类配体激活转录子，参与数种基因的调控，如外源性代谢酶CYP450中CYP1A1的形成，可在卵巢中分泌类固醇的间质细胞、卵泡颗粒细胞和黄体细胞中表达；被激活的CYP1A1能将环境中的多种有机物质如PAHs转化为细胞毒素或其他致癌物质，从而增加癌症发生危险。有研究[10,11]显示，苯并芘能激活AhR诱导CYP450转录表达，将苯并芘代谢为活性化合物7，8-二氢二醇-9，10-环氧苯并(a)芘，与DNA形成加合物，导致卵巢颗粒细胞中活性氧的形成，从而损伤卵巢功能。Sobinoff等[7]发现，在卵巢中苯并芘通过激活AhR诱导CYP450代谢和氧化应激反应，使基因表达、细胞周期、细胞生长发育和细胞间的信号传导等受影响，可激活未成熟的原始卵泡、损伤卵母细胞并使生长卵泡发生闭锁，导致组织发生损伤效应。有研究[12,13]显示，PBDEs可能通过激活AhR或诱导CYP450高表达等发挥致癌、致突变功能。Talsness等[14]研究发现，孕期雌性大鼠暴露于PBDEs，可导致卵巢细胞结构异常，影响生殖功能。目前国内外关于苯并芘的研究较多，BDE-3的研究较少，而同时探讨两者在哺乳动物体内联合效应的研究更少。本研究结果显示，苯并芘、BDE-3染毒的大鼠血清孕酮及卵巢组织中AhR和CYP1A1表达水平均较未染毒大鼠明显增高，且联合暴露较于苯并芘和BDE-3的单独作用各指标增高更明显。因此，我们认为苯并芘和BDE-3暴露对卵巢功能产生损伤效应，且联合暴露可产生协同作用；其损伤机制可能是通过AhR调控CYP1A1表达，从而增强对卵巢组织的毒性效应。然而，关于两者协同效应的机制尚需进一步研究。

[1] Barouki R, Coumoul X, Fernandez-Salguero PM. The aryl hydrocarbon receptor, more than a xenobiotic-interacting protein[J]. FEBS Lett, 2007,581(19):3608-3615.

[2] Stejskalova L, Dvorak Z, Pavek P. Endogenous and exogenous ligands of aryl hydrocarbon receptor: current state of art[J]. Curr Drug Metab, 2011,12(2):198-212.

[3] Birnbaum LS, Staskal DF. Brominated flame retardants: cause for concern[J]. Environ Health Perspect, 2004,112(1):9-17.

[4] 万斌,郭良宏.多溴联苯醚的环境毒理学研究进展[J].环境化学,2011,30(1):143-152.

[5] Darnerud PO, Risberg S. Tissue localisation of tetra- and pentabromodiphenyl ether congeners (BDE-47, -85 and -99) in perinatal and adult C57BL mice[J]. Chemosphere, 2006,62(3):485-493.

[6] Guo J, Xu Y, Ji W, et al. Effects of exposure to benzo[a]pyrene on metastasis of breast cancer are mediated through ROS-ERK-MMP9 axis signaling[J]. Toxicol Lett, 2015,234(3):201-210.

[7] Sobinoff AP, Pye V, Nixon B, et al. Jumping the gun: smoking constituent BaP causes premature primordial follicle activation and impairs oocyte fusibility through oxidative stress[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2012,260(1):70-80.

[8] Aschebrook-Kilfoy B, Dellavalle CT, Purdue M, et al. Polybrominated diphenyl ethers and thyroid cancer risk in the Prostate, Colorectal, Lung, and Ovarian Cancer Screening Trial cohort[J]. Am J Epidemiol, 2015,181(11):883-888.

[9] Tian S, Pan L, Sun X. An investigation of endocrine disrupting effects and toxic mechanisms modulated by benzo pyrene in female scallop chlamys farreri[J]. Aquat Toxicol, 2013，144-145:162-171.

[10] Ramesh A, Archibong AE, Niaz MS. Ovarian susceptibility to benzo(a)pyrene: tissue burden of metabolites and DNA adducts in F-344 rats[J]. J Toxicol Environ Health A, 2010,73(23):1611-1625.

[11] Safe S, McDougal A. Mechanism of action and development of selective aryl hydrocarbon receptor modulators for treatment of hormone-dependent cancers[J]. Int J Oncol, 2002,20(6):1123-1128.

[12] 王若希,刘晓晖,邵静,等.多溴联苯醚致癌效应研究进展[J].中国预防医学杂志,2012,13(12):947-950.

[13] Courter LA, Musafia-Jeknic T, Fischer K, et al. Urban dust particulate matter alters PAH-induced carcinogenesis by inhibition of CYP1A1 and CYP1B1[J]. Toxicol Sci, 2007,95(1):63-73.

[14] Talsness CE, Shakibaei M, Kuriyama SN, et al. Ultrastructural changes observed in rat ovaries following in utero and lactational exposure to low doses of a polybrominated flame retardant[J]. Toxicol Lett, 2005,157(3):189-202.

广西自然科学基金资助项目(2013GXNSFBA019190)；广西高校科学技术研究项目(2013ZD044)。

庞伟毅(E-mail： p.weiyi@live.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.18.008

R114

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1002-266X(2017)18-0026-03

2017-02-23)