胃癌细胞来源的exosomes对Jurkat T细胞凋亡的影响及机制探讨

张玉峰，叶坤英，钟丹

(1河南中医药大学第二临床医学院，郑州450002；2井冈山大学医学院 )

胃癌细胞来源的exosomes对Jurkat T细胞凋亡的影响及机制探讨

张玉峰1，叶坤英1，钟丹2

(1河南中医药大学第二临床医学院，郑州450002；2井冈山大学医学院 )

目的 观察胃癌细胞来源的外来体exosomes对Jurkat T细胞凋亡的影响，并探讨其可能的机制。方法 将人低分化胃腺癌细胞株进行培养、传代等处理，分离获得外来体exosomes。将消化后的Jurkat T细胞随机分为观察组与对照组，观察组分别加入50、100、200、400 μg/mL的exosomes，对照组不加exosomes，采用流式细胞仪测算培养12、24 h 时Jurkat T细胞凋亡率,免疫细胞化学法检测培养24 h时Jurkat T细胞中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspases-3)、Caspase-8。结果 与对照组比较，观察组随着exosomes浓度增加及作用时间的延长，Jurkat T细胞凋亡率均增加(P均<0.05)；与对照组比较，观察组Jurkat T细胞中的Caspases-3、Caspase-8蛋白表达上调，差异有统计学意义(P均<0.05)。结论 胃癌细胞来源的外来体exosomes可诱导Jurkat T细胞凋亡，该作用与其上调Caspases-3、Caspase-8蛋白表达有关。

胃癌；外来体exosomes；Jurkat T细胞；细胞凋亡；半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的一类疾病，细胞凋亡异常是引发恶性肿瘤的主要原因之一[1,2]。细胞凋亡是一个生理性自我毁灭过程，在维持生物体内环境稳定、细胞防御等方面均起到非常重要的作用。在细胞凋亡过程中，半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspases)家族是介导者及执行者[3～5]；其可诱导免疫细胞凋亡，导致机体免疫监视能力下降，从而发生肿瘤免疫耐受[6～8]，但具体机制尚不十分清楚。exosomes来源于多囊体的膜被囊泡，可由多种活细胞分泌，具有独特的蛋白质和脂质成分，是近年来研究的热点之一。Jurkat T细胞是人急性淋巴细胞白血病细胞株，属于CD4+T 淋巴细胞；研究Jurkat T细胞能反映细胞免疫变化，如肿瘤中出现Jurkat T细胞凋亡则提示免疫耐受发生。2016年6～10月，我们观察了胃癌细胞来源的exosomes对Jurkat T细胞凋亡的影响，并探讨其可能的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人低分化胃腺癌细胞株872-3及Jurkat T细胞购自上海艾研生物科技有限公司，RPMI1640培养基购自Gibco公司，胎牛血清购自天津血液病研究所；CyFlow®Cube8流式细胞仪购自Partec公司。兔抗人Caspase-3和Caspase-8抗体均购自Lab Vision公司，辣根过氧化物标记的兔抗羊、羊抗鼠二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司；SIGMA 6K15冷冻离心机购自Sigma公司，722S分光光度仪购自上海精密科学仪器有限公司，HH-SH-1水浴箱购自北京长安科学仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 胃癌细胞来源exosomes的获取 将低分化胃腺癌细胞株872-3接种在加有胎牛血清及12 kU/L庆大霉素的RPMI1640培养基中，置于37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱内培养；以0.25%胰酶消化传代，每2～3天传代1次。收集培养细胞的上清液，去除细胞及碎片，经离心、加MWCOAmicon等处理后，所得浓缩液即为exosomes。取部分exosomes进行超速离心沉淀，加2%多聚甲醛和0.25%戊二醛固定；PBS液洗涤3次(15 min/次)，梯度乙醇脱水，环氧树脂浸透过夜；经包埋、切片、铅铀染色等处理后，电镜下观察细胞形态。电镜下细胞形态为圆球体，有盘状脂质膜包绕，形态大小不一，直径在30～100 nm,成功制备exosomes。

1.2.2 Jurkat T细胞培养与分组处理 将Jurkat T细胞接种在加有胎牛血清及12 kU/L庆大霉素的RPMI1640培养基中，置于37 ℃、饱和湿度、5% CO2培养箱内培养；以0.25%胰酶消化液消化传代，每2～3天传代1次。将消化后的Jurkat T细胞调整细胞密度为1×106/mL，接种在96孔板，每孔100 μL细胞悬液。将细胞随机分为观察组与对照组，对照组不加exosomes，观察组分别加入50、100、200、400 μg/mL浓度的exosomes，放入37 ℃温箱内培养。

1.2.3 Jurkat T细胞凋亡率测算 采用流式细胞术。分别于培养12、24 h取两组细胞，分离取得沉淀细胞，收集在流式细胞管中。用PBS洗涤2次，加冷70%的乙醇过夜；再用PBS洗涤2次，加20 mg/L的RNase A在37 ℃下孵育30 min；再加入20 mg/L的PI，避光孵育30 min。上流式细胞仪检测凋亡细胞，DNA无法被染色或可染性降低为凋亡细胞，计算细胞凋亡率。

1.2.4 Jurkat T细胞中Caspase-3、Caspase-8蛋白检测 采用Western blot法。取对照组及观察组400 μg/mL exosomes培养24 h的细胞，用0.1%胰蛋白酶消化成单细胞悬液，以PBS冲洗2次(5 min/次)。加入蛋白裂解液，冰上放置15～20 min；在4 ℃下以1 200 r/min离心5 min，提取蛋白；进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将分离胶底部转印硝酸纤维素膜上；硝酸纤维素膜上滴加Caspase-3与Caspase8抗体，4 ℃下过夜； PBS洗涤后，加二抗孵育过夜；PBS洗涤，DAB显色、封片，以电泳条带灰度值表示Caspase-3、Caspase-8的表达量。

2 结果

2.1 两组Jurkat T细胞凋亡率比较 与对照组比较，观察组随着exosomes浓度增加、作用时间的延长Jurkat T细胞凋亡率逐渐增加(P均<0.05)。见表1。

表1 两组Jurkat T细胞凋亡率比较

注：与对照组同时点比较，*P<0.05；与观察组上一浓度比较，#P<0.05；与观察组同浓度12 h时比较，△P<0.05。

2.2 两组Jurkat T细胞中Caspase-3、Caspase-8蛋白表达比较 与对照组比较，观察组Jurkat T细胞中Caspase-3、Caspase-8蛋白表达均增加(P均<0.05)。见表2。

表2两组Jurkat T细胞中Caspase-3、Caspase-8蛋白表达比较

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

肿瘤的免疫治疗已成为临床研究的热点，但仍有很多问题尚未研究清楚。免疫缺陷及免疫耐受等是影响免疫治疗疗效的主要原因，而研究发现肿瘤细胞分泌的exosomes能诱导肿瘤产生免疫耐受[6,7]，导致机体的免疫监视功能下降，但具体机制尚不十分清楚。

细胞凋亡是一个生理性的细胞自我毁灭过程，在胚胎发育、生物体内环境稳定、细胞防御内外伤害等方面起到非常重要的作用。exosomes最先是由Trams等在1981年被研究发现，是由活细胞分泌产生的，具有影响细胞凋亡的作用，与细胞坏死碎片和凋亡小体有明显区别[11]。exosomes是细胞膜内陷形成的早期内体，内体内有多量的小泡多泡体，这种多泡体可与细胞膜融合，将小泡释放在泡外空间，这种小泡即为exosomes。很多类型的细胞均能释放exosomes，但主要由免疫细胞和肿瘤细胞释放。肿瘤细胞和免疫细胞释放的exosomes可表达热休克蛋白、共刺激分子、肿瘤抗原等，因此可诱导机体的抗肿瘤效应，具有抗肿瘤作用。近年来临床大量研究显示[12～15]，exosomes在体内能直接表现为免疫抑制。曲晶磊等[14]研究显示，胃细胞来源的exosomes有促进肿瘤细胞增殖作用，其作用机制是通过激活PI3K和MAPK/ERK信号通路来实现的。有研究结果显示，exosomes可通过抑制T细胞活化的信号分子JAK3来诱导T细胞凋亡[8]，可下调NK细胞表面的NKG2D表达[9,10]，认为可能是通过以上途径来起到免疫抑制作用。杨林等[15]研究了肾癌细胞来源的exosomes介导肿瘤免疫逃逸的机制，结果显示Jurat T细胞凋亡增加，在细胞凋亡过程中存在Caspase-3、8、9表达上调。

在细胞凋亡过程中，Caspases家族中一类为起始者、一类为执行者。起始者Caspase可在外来蛋白信号的作用下被激活，然后激活执行者Caspase并水解Caspase靶蛋白，启动细胞的凋亡程序。Caspase-2、8、9、10属于起始者，Caspase-3、6、7属于执行者，起始者可活化执行者，两者之间是上下游的关系。其中，Caspases-3、Caspase-8是在执行与起始中处于核心地位的两种蛋白酶，在凋亡的多途径信号通路关键步骤中均有参与。研究[16～20]发现，Caspase-8活化时特异性识别Caspase-3抑制酶(DEVD)，能剪切多聚ADP-核糖聚合酶，经“诱导接近模式”活化后可引发Caspase的级联反应，进一步水解激活下游的同源酶(如Caspase-6、3、7)；这种反应是在细胞质中进行，可在细胞质中裂解Bcl-2家庭成员Bid，裂解产物的羧基片段tBid可转移在线粒体上，诱导线粒体释放细胞色素C，促使死亡受体通路与线粒体通路联系起来，最后发生凋亡激活生物效应。Caspase-3属于效应性Caspase，是细胞凋亡过程中的关键元件，其异常表达可引起细胞凋亡。Caspase-3在凋亡的级联反应下游，是凋亡的执行者。其引起凋亡的机制主要是对某些蛋白质进行切割，通过阻滞细胞周期、促使细胞从周围组织结构中脱落、破坏细胞的自我修复机制、引起维持细胞结构的物质解体等途径来诱发细胞凋亡[19～21]；另外，其可通过对Fas介导的死亡信号途径来抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达，催化参与DNA修复的聚合酶发生裂解；同时，其还可引起Caspase活化DNA酶(CAD)、DNA片段化因子(DFF)等核酸内切酶活化，使DNA在核小体连接处被切割，产生DNA片段，进而裂解细胞骨架蛋白、核蛋白、细胞外基质蛋白等关键结构蛋白和看家蛋白，引起细胞形态发生异常，导致细胞与环境间的联系被割断，最终引起细胞凋亡。本研究对胃癌细胞来源的exosomes诱导Jurkat T细胞凋亡时Caspases-3、Caspase-8表达变化进行研究，结果显示胃癌细胞来源的exosomes能明显诱导Jurkat T细胞凋亡，且随时间推移及浓度增加Jurkat T细胞凋亡率随之增加，同时可引起Caspases-3、Caspase-8表达上调。

综上所述，胃癌细胞来源的外来体exosomes可诱导Jurkat T细胞凋亡，其机制可能是通过上调Caspases-3、Caspase-8表达实现的，但是具体机制尚需要进一步深入研究。进一步深入研究胃癌细胞来源的exosomes诱导Jurkat T细胞凋亡机制，可为胃癌的免疫靶向治疗提供了一个新的思路。

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Effect of exosomes derived from gastric cancer cells on apoptosis of Jurkat T cells

ZHANGYufeng1,YEKunying,ZHONGDan

(1TheSecondClinicalMedicalCollegeofHenanUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450002,China)

Objective To observe the effect of exosomes derived from gastric cancer cells on apoptosis of Jurkat T cells and to discuss the possible mechanism. Methods Exosomes was separated by culturing low differentiated gastric cancer cell strains. The digested Jurkat T cells were divided into the observation group and control group (without esosomesexosomes), cells in the the observation group were respectively added with 50, 100, 200, and 400 μg/mL esosomesexosomes. Flow cytometry was used to detect the apoptosis of Jurkat T cells at 12 and 24 h, and the expression of Aspartic proteinase Caspase-3 and Caspase-8 in Jurkat T cells was tested by immunocytochemistry.Results The apoptosis of Jurkat T cells in the observation group increased with the increasing concentrations of exosomes and the prolonged time as compared with that of the control group (allP<0.05). The expression of Caspases-3 and Caspase-8 in the Jurkat T cells increased in observation group as compared with that of the control group and the difference was statistically significant (allP<0.05).Conclusion Exosomes derived from gastric cancer cell strains induces the apoptosis of Jurkat T cells, and it may related to the up-regulated expression of Caspases-3 and Caspase-8.

gastric carcinoma; exosomes; Jurkat T cells; cell apoptosis; Caspase

河南省中医药科学研究专项课题资助项目(2014ZY02027)。

张玉峰(1969-)，男，副教授，副主任医师，主要研究方向为中医药防治消化病。E-mail: zhouyihb@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.18.002

R735.2

A

1002-266X(2017)18-0005-04

2017-01-03)