生长激素对人外周血来源NK细胞杀伤活性的影响及机制探讨

徐瑞玉，安新荣，陈晓琳，孟维霞，李珍珠，李泽福

(滨州医学院附属医院，山东滨州 256600)

生长激素对人外周血来源NK细胞杀伤活性的影响及机制探讨

徐瑞玉，安新荣，陈晓琳，孟维霞，李珍珠，李泽福

(滨州医学院附属医院，山东滨州 256600)

目的 观察生长激素(GH)对人外周血来源自然杀伤(NK)细胞杀伤活性的影响，并探讨其机制。方法 选取10名健康志愿者，采用免疫磁珠法分离并培养其外周血NK细胞。将NK细胞分为A、B、C组，分别与终浓度0、5 、20 μg/mL的重组人GH共培养48 h。以人类髓性白血病K562细胞为靶细胞，NK细胞为效应细胞，按不同的效靶比(25∶1、50∶1、100∶1)混合，采用CCK-8 法检测NK细胞对K562细胞的杀伤率；取各组培养48 h的NK细胞，分别采用流式细胞术和Real-time RT-PCR法检测NK细胞表面活化受体NKG2D蛋白及基因。结果 三个不同效靶比下，B、C组NK细胞对K562细胞的杀伤率高于A组，且C组高于B组(P均<0.01)。A、B、C组NKG2D阳性表达的NK细胞百分数分别为78.8%±2.8%、87.5%±3.1%、91.8%±3.3%，B、C组NKG2D阳性表达的NK细胞百分数高于A组(P均<0.05)。A、B、C组NKG2D mRNA相对表达量分别为1±0.01、5±2.32、10±3.21，B、C组NKG2D mRNA相对表达量高于A组，且C组高于B组(P均<0.05)。结论 GH可通过上调NK细胞NKG2D的表达，增强其杀伤活性。

生长激素；自然杀伤细胞；杀伤作用；NK细胞表面活化受体；神经-内分泌-免疫

生长激素(GH)在人体生长发育过程中起重要作用[1]，也可作为应激性激素参与免疫调节，在人体适应环境过程中发挥重要作用[2]。目前，GH对免疫系统影响的具体机制尚不清楚[3,4]。研究发现，GH缺乏会影响免疫器官的发育，如胸腺[5,6]；同时，在缺少GH的儿童体内有多种免疫细胞功能下降[7]。然而，在长期大剂量GH作用下也会导致相应的免疫功能受损，如长期滥用GH的运动员更易感染疾病。NKG2D是NK细胞表面重要的活化受体之一，与其配体结合后能直接影响NK细胞的杀伤活性[8～10]。早在上个世纪80年代，就有学者发现GH能影响NK细胞免疫活性[11]，但具体机制尚不清楚。随着近年来对神经-内分泌-免疫研究的深入，有必要进一步深入研究GH对NK细胞的影响。2015年2月～2016年7月，我们观察了rhGH对人外周血NK细胞杀伤活性的影响，并检测NKG2D的表达变化，为神经-内分泌-免疫通路提供理论补充。

1 材料与方法

1.1 材料 重组人生长激素(rhGH,Sciencell,美国)；PBS(武汉博士德生物工程有限公司)；人淋巴细胞分离液 Ficoll-Paque(天津灏洋生物有限公司)；胎牛血清及含双抗RPMI1640培养基(Hyclone, 美国)；CCK-8试剂盒 (同仁化工, 日本)；重组人白细胞介素2(rhIL-2，Gibco, 美国)；藻红蛋白(PE)标记的小鼠抗人CD56单克隆抗体、异硫氰酸荧光素(FITC)标记小鼠抗人NKG2D(CD314)及NK细胞miniMACS免疫磁珠分选系统(Miltenyi Biotec,德国)；Real-time RT-PCR试剂盒(大连宝生物工程有限公司)；PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)；人类髓性白血病K562细胞系由我院实验室提供。

1.2 实验方法

1.2.1 NK细胞的分离与纯化 于滨州医学院招聘10名健康志愿者，男7名、女3名,平均年龄21.5岁，无体育专业者；均签署知情同意书，并获校伦理委员会批准。筛查其静息下血GH水平均正常后，抽取静息空腹外周静脉血20 mL，肝素抗凝备用。通过密度梯度离线法吸取中间云雾层单个核细胞(PBMC)，PBS洗涤2次；按每107个细胞加入70 μL Buffer重悬后，再加入20 μL CD56磁珠抗体，在2～8 ℃环境下孵化15 min；加入1 mL Buffer 混匀后以300 r/min离心5 min，再加500 μL Buffer 重悬。选用MS分离柱，放于miniMACS分离磁场中，使用前用Buffer 500 μL 湿润柱壁；放置收集管，将重悬的细胞上柱，再加用3×500 μL Buffer洗柱。最后将分离柱脱离磁场，放置新的收集管上，快速推注1 mL Buffer冲下NK细胞。收集NK细胞培养，取少量细胞用CD56-FITC标记验证纯度>95%。

1.2.2 NK细胞培养与分组处理 将NK细胞密度调整为2× 105/mL，以1 mL/孔接种于含10%灭活胎牛血清、IL-2 (100 U/mL) 的RPMI1640培养体系的24孔板中，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养。将NK细胞分为A、B、C组，分别与终浓度0、5 、20 μg/mL的rhGH共培养。

1.2.3 NK细胞杀伤活性观察 收集对数生长期的K562细胞及培养48 h 的NK细胞，以K562细胞为靶细胞，NK细胞为效应细胞，按不同的效靶比(25∶1、50∶1、100∶1)混合；同时单设靶细胞孔、效应细胞孔和培养基空白对照孔，均设3个平行复孔，置37 ℃、5%CO2培养箱中培养12 h；每孔加入CCK-8 10 μL，混匀后继续培养4 h；用酶标仪测定每孔450 nm波长处的OD值，计算3个平行孔的平均值。细胞杀伤活性=[1-(效靶细胞作用孔OD值-效应细胞孔OD值)/靶细胞OD值]×100%。

1.2.4 NK细胞中NKG2D 蛋白检测 采用流式细胞术。取培养48 h的NK细胞100 μL(1×105～1×106个细胞)，加荧光抗体CD56-FITC、NKG2D-PE各10 μL，充分混匀后4 ℃避光静置30 min；以5 mL PBS洗涤1次，1 200 r/min离心10 min，弃上清。加入300～500 mL PBS，上流式细胞仪检测NKG2D阳性表达的NK细胞百分数，以此观察NKG2D 蛋白表达情况。

1.2.5 NK细胞中NKG2D mRNA检测 采用Real-time RT-PCR法。取培养48 h的NK细胞，破膜后提取其mRNA；然后反转录为 cDNA，以β-actin为内参基因实时定量分析NKG2D的含量。NKG2D上游引物为5′-AAGCTTAGGATGGGGTGGATTCGTGGTC-3′，下游引物为5′-GAATTCCCACAGTCCTTTGCATGCAGATGTA-3′；β-actin上游引物为 5′-CTGGGACGACATGGAGAAA-3′，下游引物为5′-AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC-3′。反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min、58 ℃退火1 min、72 ℃延伸1 min，共35个循环；72 ℃再延伸10 min。以2-ΔΔCt计算NKG2D mRNA相对表达量。

2 结果

2.1 各组NK细胞杀伤活性比较 见表1。

表1 各组NK细胞对K562细胞的杀伤活性比较

注：与A组同一效靶比比较，*P<0.01；与B组同一效靶比比较，#P<0.01。

2.2 各组NK细胞中NKG2D 蛋白表达比较 A、B、C组NKG2D阳性表达的NK细胞百分数分别为78.8%±2.8%、87.5%±3.1%、91.8%±3.3%，B、C组NKG2D阳性表达的NK细胞百分数高于A组,且C组高于B组(P均<0.05)。

2.3 各组NK细胞中NKG2D mRNA表达比较 A、B、C组NKG2D mRNA相对表达量分别为1±0.01、5±2.32、10±3.21，B、C组NKG2D mRNA相对表达量高于A组，且C组高于B组(P均<0.05)。

3 讨论

GH是人体生长发育不可或缺的激素，主要作用为调控机体生长发育，同时也参与机体应激反应。人体内GH分泌量通常在一个正常范围波动，但当机体处于应激状态时，其分泌量将剧烈上升，其结果有利于升高血糖，有利于心脑等重要脏器的能量补充[1]；同时应激状态也会激活免疫系统[10]，而这有利于抵抗一些恶劣环境或者严重的微生物感染[12]。

GH可与GH受体(GHR)相结合来发挥作用[5]，目前发现GHR表达于淋巴细胞、NK细胞、成纤维细胞、巨噬细胞、软骨细胞等。研究[13]发现，GHR主要表达于T淋巴细胞及NK细胞等外周血免疫细胞的表面。NK细胞发挥免疫活性时不需要抗原的递呈，它可以通过细胞表面的各种活化受体直接来识别靶细胞，并且发挥免疫杀伤作用，其作用较为迅速。NKG2D是NK细胞表面主要活化受体之一，其配体较为多样，也存在种属差异[3]。例如，配体人组织相容性复合物类似物-1(MICA)主要表达在人体内，鼠类并不表达。NKG2D的配体在应激状态时会表达上调，例如感染、肿瘤等[14]。

本实验发现，加入GH能够显著上调NK细胞表面NKG2D膜蛋白及相应mRNA的表达，细胞毒性实验发现NK细胞在含有GH环境下其杀伤能力显著提高。目前，GH能在体内外激活NK细胞的杀伤活性已被广泛报道。一项双盲实验在人体上进行，通过注射rhGH或安慰剂来研究GH对NK细胞的活性，发现注射rhGH后志愿者体内NK细胞数目及杀伤活性要明显强于注射安慰剂组[7]。通过对缺乏GH患者的研究发现，相比正常人其体内的NK细胞在数目及杀伤活性均下降；然后在经过GH替代治疗3个月后，NK细胞的数目及杀伤活性又恢复至正常水平[15]。但是，GH对NK细胞的影响似乎远非如此简单。例如，在高GH血症的肢端肥大症患者体内，并没有发现NK细胞免疫活性高过正常人，甚至这一类患者往往伴有垂体瘤或大肠癌的发生[4]。本实验以表面活化受体NKG2D为观察指标，来探究GH对NK细胞的作用，该研究结果补充了神经-垂体-免疫轴信号途径，同时也为临床合理应用GH提供了重要理论基础。

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Effect of growth hormone on cytotoxicity of NK cells from PBMC

XURuiyu,ANXinrong,CHENXiaolin,MENGWeixia,LIZhenzhu,LIzefu

(TheAffiliatedHospitalofBinzhouMedicalUniversity,Binzhou256600,China)

Objective To investigate the effect of growth hormone on the cytotoxicity of natural killer (NK) cells from human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and the possible mechanism. Methods NK cells, purified by magnetic activated cell sorting (MACS) from 10 volunteers, were divided into three groups. Cells in the groups A, B and C were co-cultured with recombinant human growth hormone (rhGH) (A∶0 μg/mL, B:5 μg/mL, C:20 μg/mL). After 48 h, the cytotoxicity of NK cells against K562 cells, with different effector-target ratio (25∶1, 50: 1, 100∶1), was analyzed by CCK-8. Real-time RT-PCR and flow cytometry were used to detect the expression of natural killer cell group 2 member D (NKG2D), in the levels of gene and protein molecules. Results The cytotoxicity of NK cells against K562 cells in the group B and C was significantly higher than that in the group A at different effector-target ratio, and group C was higher than group B (allP<0.01). The percentages of NK cells with positive expression of NKG2D in the groups A, B and C were 78.8%±2.8%, 87.5%±3.1% and 91.8%±3.3%, respectively, and group B and C were higher than group A (allP<0.05). The relative expression of NKG2D mRNA of NK cells in the groups A, B and C was 1±0.01, 5±2.32 and 10±3.21 respectively. The expression of NKG2D mRNA in the group B and C was significantly higher than that of group A, and group C was higher than group B (allP<0.05). Conclusion Growth hormone may enhance the cytotoxicity of NK cells from PBMC by up-regulating the expression of NKG2D.

growth hormone; natural killer cells; killing effect; natural killer cell group 2 member D; nerve-endocrine-immune

国家自然科学基金资助项目(81171119)；滨州医学院科研计划课题项目(BY2015KJ28)。

徐瑞玉(1988-)，女，学士，主要研究方向为内分泌与免疫。E-mail: timeanddoctor@hotmail.com

李泽福(1969-)，男，博士，主任医师，主要研究方向为神经与免疫。E-mail: lizefu@bzmc.edu.cn

李珍珠(1987-)，男，医师，硕士，主要研究方向为神经与免疫。E-mail: lizhenzhu@bzmc.edu.cn

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.18.006

R392

A

1002-266X(2017)18-0020-03

2016-10-26)