miRNA-204靶向LC3B在AngⅡ诱导的心肌肥厚中的作用

黄炯华，戴文军，林育辉，伍金雷，谢文杰，陈永权

(广州医科大学附属第三医院心血管内科 510150)

miRNA-204靶向LC3B在AngⅡ诱导的心肌肥厚中的作用

黄炯华，戴文军，林育辉，伍金雷，谢文杰，陈永权

(广州医科大学附属第三医院心血管内科 510150)

[摘要] 目的 探讨体外血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导原代大鼠心肌细胞肥大中miRNA-204靶向自噬微管相关蛋白轻链3B(LC3B)表达的作用。方法 以原代大鼠心肌细胞为研究对象，根据不同的处理分为对照组、AngⅡ组、联合1组(心肌细胞给予人AngⅡ刺激同时感染阴性对照慢病毒载体)和联合2组(心肌细胞给予人AngⅡ刺激同时感染miRNA-204慢病毒过表达载体)。各组在干预治疗后48～72 h，行激光共聚焦检测心肌细胞肥大变化，荧光定量PCR探测miRNA-204的表达,蛋白印迹测定LC3B的表达；同时，双荧光素酶活性基因报告验证miRNA-204的靶基因。结果 与对照组比较，AngⅡ组心肌细胞相对表面积明显增大，同时LC3B蛋白表达明显升高、miRNA-204表达上调，差异均有统计学意义(P<0.05)。与联合1组比较，联合2组能明显减少LC3B蛋白表达，同时使心肌细胞相对表面积缩小(P<0.05)。进一步的荧光素酶活性报告基因实验结果提示，miRNA-204能结合LC3B的非翻译区的野生型片段减少荧光素霉活性(P<0.05)；但不能结合其突变型片段灭活荧光素酶活性(P>0.05)。结论 miRNA-204能抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，其作用是通过靶向LC3B的表达实现的。

微RNA-204；心肌肥厚；血管紧张素Ⅱ；原代大鼠心肌细胞

心脏在各种压力(如压力负荷、体内神经体液因子等)刺激下，促进心脏代偿性心肌肥厚，最终会进展成为心力衰竭。既往研究表明，左心室肥厚是心脑血管事件的独立危险因素[1]。为此，探索抑制心脏肥厚的新机制有望为心力衰竭的防治提供重要的线索。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，AngⅡ)在压力负荷诱导心脏肥厚的发生、发展及维持中有着至关重要的作用。有研究表明，微RNA(microRNA，miRNA)是生物体内源的非编码RNA，其通过结合基因非编码区域的互补片段(3′-URT)来分解或抑制基因转录表达[2]。此外，压力负荷诱导的大鼠心脏肥厚的心脏组织miRNA基因芯片测定表明，miRNA-204表达下调[3]；而作者前期研究发现，压力负荷诱导的心脏肥厚其心肌组织中存在自噬微管相关蛋白轻链3B(LC3B)表达上调[4]，体外AngⅡ诱导的原代大鼠心肌细胞肥大中，LC3B表达结果与体内一致[5]。通过网络基因信息软件targetscan预测，LC3B是miRNA-204的靶基因。然而，miRNA-204在心肌细胞中，是否靶向作用LC3B的表达及其对AngⅡ诱导的心肌肥厚是否有调控作用尚不明确。本研究以AngⅡ诱导原代大鼠心肌细胞肥大为模型，探讨miRNA-204靶向LC3B表达在心肌肥厚中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)动物：1～3 d的SD乳鼠由广州医科大学实验动物中心提供，体质量5～10 g。(2)试剂及仪器：E.Z.N.ATM Blood DNA Kit反应试剂盒购自美国Omega公司；pGL3荧光报告质粒及内对照质粒pRL-TK购自invitrogen公司；AngⅡ购自美国Sigma公司；Alexa Fluor555 Phalloidin购自美国Invitrogen公司；Trizol购自美国Invitrogen公司；PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis kit购自日本Takara公司；定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Kit购自日本Takara公司；NP-40裂解液购自上海Beyotime公司；单克隆抗体LC3B购自Cell Signaling Technology公司；单克隆抗体GAPDH购自Epitomics公司；免疫二抗体购自武汉BOIWORLD公司；曝光液购自上海Beyotime公司；阴性对照慢病毒载体、miRNA-204慢病毒过表达载体由上海吉玛公司构建；Zeiss LSM 710的激光共聚焦仪购自德国公司。

1.2 方法

1.2.1 携带LC3B非编译区域野生型片段和突变型片段质粒构建 通过E.Z.N.ATM Blood DNA Kit反应试剂盒的操作方法从大鼠血样品中获取基因组DNA。大鼠LC3B 3′-URT野生型片段和突变型片段通过融合PCR方法从大鼠基因组DNA中获取，同时予ECOR I和Xba Ⅰ酶切野生型片段、突变型片段和pGL3荧光报告载体，用连接酶连接构建获得相应质粒，分别命名为pGL3-LC3B 3′-URT-Wild Type 和pGL3-LC3B 3′-URT-Mutant。

1.2.2 细胞培养和治疗分组 原代大鼠心肌细胞通过胰酶消化出生1～3 d的SD乳鼠心脏获取，参照文献[6]报道进行培养。根据不同的处理分成4组：对照组(心肌细胞未予特殊处理)、AngⅡ组(心肌细胞给予1 μmol/L AngⅡ刺激)、联合1组(心肌细胞给予AngⅡ刺激同时感染阴性对照慢病毒载体)、联合2组(心肌细胞给予AngⅡ刺激同时感染miRNA-204慢病毒过表达载体)。慢病毒感染心肌细胞以4×105心肌细胞数加进20 μL病毒液和凝聚胺使得其终浓度为5 μg/mL。而pGL3携带LC3B 3′-URT-Wild Typy或 3′-URT-Mutant质粒及内对照质粒pRL-TK转染心肌细胞时则根据Lipofectamine LTX and PLUS Reagents试剂盒说明书进行。

1.2.3 激光共聚焦检测 心肌细胞收集后用3.7%多聚乙醛在常温下孵育，并用PBS-T稀释的1% Trion X进行孵育15 min破膜。然后，心肌细胞用Alexa Fluor555 Phalloidin(按1∶35稀释)孵育25 min进行染色；最后，再加入浓度为300 nmol/L的DAPI溶液进行复染色5 min。心肌细胞图像通过Zeiss LSM 710的激光共聚焦仪获取。每个样品获取5个不同视野的图片，并通过Image-Pro Plus 6.0 软件计算平均细胞表面积，处理各组分别与对照组的平均心肌细胞表面积进行比较获取倍数值后进行统计分析。

1.2.4 荧光定量聚合酶链(qRT-PCR)检测 心肌细胞总RNA通过Trizol获取，cDNA则根据试剂盒PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis kit说明书操作方法获得。同时，定量PCR根据试剂盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Kit操作说明在购自瑞士Roche公司的荧光定量PCR仪进行测定。U6作为miRNA-204的内对照，相对表达水平通过计算2-△△CT方法获取。其相关引物序列如下，U6逆转录引物序列：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′；荧光定量PCI引物序列上游：5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′，下游：5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3′。miRNA-204逆转录引物序列：5′-GTC GTA TCC AGT GCG TGT CGT GGA GTC GGC AAT TGC ACT GGA TAC GAC AGG CAT AG-3′；荧光定量PCI引物序列上游：5′-GCC CTT CCC TTT GTC ATC-3′，下游：5-′CAG TGC GTG TCG TGG AGT-3′。

1.2.5 细胞蛋白抽提和蛋白印迹检测 心肌细胞收集后采用NP-40裂解液进行抽提，蛋白浓度通过BCA法测定。约取样品40 μg蛋白进行电泳分离和转膜。将承载有目的蛋白膜用5%脱脂奶粉进行封闭1 h，然后加入单克隆抗体LC3B和单克隆抗体GAPDH于4 ℃孵育过夜。孵育过夜的蛋白膜用PBS-T液洗涤后，加入免疫二抗体进行孵育免疫共沉淀反应。免疫复合物通过曝光液进行曝光获取底片。LC3B蛋白表达量用内对照蛋白GAPDH标准化后计算获得。

1.2.6 双荧光素酶活性基因报告测定 为了更好地评价miRNA-204是否调控LC3B的表达，作者进行双荧光素酶基因报告测定。心肌细胞以每孔5×104数量种植到24孔板中进行培养。(1)将miRNA-204模拟物和对照物、miRNA-204抑制物和对照物通过试剂盒Lipofectamine®RNAiMAX Reagent在心肌细胞进行转染12 h；(2)根据Lipofectamine LTX and PLUS Reagents试剂盒说明书进行操作，同时将3′-URT-Wild Typy或 3′-URT-Mutant质粒及内对照质粒pRL-TK共转染进心肌细胞并孵育48 h；(3)将心肌细胞收集，在Lumat LB9507荧光细胞收集仪测定海肾素酶和萤火素酶的活性。通过内对照载体pRL-TK提供海肾素霉活性的表达来标准化萤火素霉活性的表达量。

2 结 果

2.1 对照组与AngⅡ组心肌细胞表面积比较 浓度为1 μmol/L的AngⅡ刺激心肌细胞48 h，心肌细胞表面积较对照组明显增大，通过Image-Pro Plus 6.0 测定平均细胞表面积进行比较，AngⅡ组平均细胞表面积较对照组增多，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

A：对照组；B：Ang Ⅱ组；C：两组细胞表面积比较；a：P<0.05，与对照组比较。

a：P<0.05，与对照组比较。

A：联合1组；B：联合2组；C：两组蛋白印迹检测；D：两组细胞LC3B表达比较；a：P<0.05，与联合1组比较。

表1 双荧光素酶活性分析miRNA-204靶向LC3B的相对表达量

a：P<0.05，与miRNA对照组比较；b：P<0.05，与siRNA对照组比较。

2.2 对照组与AngⅡ组肥大心肌细胞中miRNA-204和LC3B表达水平比较 心肌细胞予AngⅡ 刺激48 h后行miRNA-204及LC3B蛋白表达测定，与对照组比较，AngⅡ组miRNA-204表达下调，而LC3B蛋白表达上调，两组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

2.3 联合1、2组心肌细胞表面积和LC3B表达比较 在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大中，通过慢病毒转染心肌细胞过表达miRNA-204，观察其对心肌细胞肥大及LC3B表达的作用。结果显示，联合1组相对细胞表面积为1.82±0.10，联合2组为1.04±0.07，两组比较差异有统计学意义(P<0.05);与联合1组比较，联合2组LC3B表达下调(P<0.05)，见图3。

2.4 LC3B是miRNA-204的靶向基因 当心肌细胞转染LC3B 3′-URT野生型载体后，同时转染miRNA-204模拟物和对照物、miRNA-204抑制物和对照物时，转染模拟物较对照物的荧光素霉活性下调(P<0.05)；转染抑制物较对照物比较荧光素霉活性上调(P<0.05)。然而，当心肌细胞转染LC3B 3′-URT突变型载体后，同时转染miRNA-204模拟物和对照物、miRNA-204抑制物和对照物时，其与各自的对照物比较荧光素霉活性变化均差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

3 讨 论

AngⅡ作为重要的神经体液因子，是心肌肥厚作用的重要启动子[7]。本研究通过AngⅡ刺激原代大鼠心肌细胞构建体外心肌细胞肥大模型。本研究结果表明，AngⅡ刺激的心肌细胞肥大中，存在miRNA-204表达下调和LC3B蛋白表达增高；同时，通过慢病毒载体感染心肌细胞过表达miRNA-204可抑制AngⅡ诱导的LC3B蛋白表达和心肌细胞肥大加剧；最后，通过双荧光素酶基因报告测定证实LC3B是miRNA-204的靶向基因。因此，实验结果进一步证实，miRNA-204靶向LC3B的表达来抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。

miRNA-204的表达水平在不同的疾病状态各有差异。在衰老相关的海马神经组织表达上调[8]，然而在一些肿瘤相关的疾病，如肾细胞癌[9]和前列腺癌细胞[10]中其表达明显下调。关于miRNA-204在心血管疾病方面的研究表明，在心肌细胞缺血再灌注损伤中其表达下调[11]；同时在β-甘油诱导的动脉钙化中，动脉平滑肌细胞的miRNA-204表达下调，过表达miRNA-204可抑制平滑肌细胞向成骨细胞分化进而减轻血管钙化[12]。既往压力负荷诱导心脏肥厚的心肌组织发现miRNA-204表达下调[3]，本研究在AngⅡ诱导的心肌细胞肥大中，也发现其表达下调。然而，其在心肌肥厚的确切作用仍不明确。事实上，miRNA-204与其他miRNA一样，可以通过结合不同的目的基因的非编码区域的互补片段进而在基因转录水平上调控其表达参与疾病的发生和发展。如miRNA-204调控Runx2蛋白的表达参与调控平滑肌细胞向成骨细胞分化[12]；miRNA-204抑制食管癌细胞FOXM1基因的表达，进而抑制其侵袭及上皮-间质转化[13]。本研究体外实验发现，AngⅡ诱导的心肌细胞肥大中，LC3B基因表达上调；通过慢病毒感染心肌细胞过表达miRNA-204可以抑制LC3B蛋白的表达，同时减轻AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。进一步的双荧光素酶基因报告检测证实，miRNA-204可结合LC3B基因的3′-URT片段，抑制其表达。本研究结果表明，miRNA-204可抑制AngⅡ诱导的心肌细胞肥大，其作用可能是通过靶向LC3B基因表达而实现。

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Role of miRNA-204 targeted LC3B in AngⅡ induced myocardial hypertrophy

HuangJionghua，DaiWenjun，LinYuhui，WuJinlei，XieWenjie，ChenYongquan

(DepartmentofCardiology,ThirdAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510150,China)

[Abstract] Objective To explore the effects of miRNA-204 targeted LC3B expression on AngⅡinduced cardiomyocytes hypertrophy.Methods The primary neonatal rat cardiomyocytes served as the research objects and divided into the control group,AngⅡ group,combination-treated group 1 (cardiomyocytes were given AngⅡstimulation,meanwhile infected by negative control lentivirus vector),combination-treated group 2 (cardiomyocytes were given AngⅡstimulation,meanwhile infected by lentivirus carrying miRNA-204 overexpression vector) according to different treatments.About 48 h to 72 h after intervention treatment,the cardiomyocyte hypertrophy change was detected by confocal microscopy,the expression of miRNA-204 was analyzed by real time PCR,the protein expression of LC3B was measured by Western blot and targeted gene of miRNA-204 was demonstrated by dual-luciferase reporter assay system.Results Compared with the control group,the cardiomyocyte relative surface area in the AngⅡ group was significantly enlarged,the protein expression of LC3B was significantly increased,the expression of miRNA-204 was up-regulated,the differences were statistically significant (P<0.05).Whereas comparing the combination-treated group 1 with combination-treated group 2,the protein expression of LC3B in the latter was down-regulated and the cell area was reduced (P<0.05).The further luciferase activity report gene experiment results suggested that miRNA-204 was able to bind to LC3B 3′-UTR and decreased the luciferase activities (P<0.05),but not to bind its mutated fragment for inactivating luciferase activity(P>0.05).Conclusion miRNA-204 is able to inhibit AngⅡinduced cardiomyocytes hypertrophy,its action is realized by targeting the expression of LC3B.

microRNA-204;myocardial hypertrophy;angiotensinⅡ;neonatal rat cardiomyocytes

黄炯华(1984-)，主治医师，博士，主要从事心肌肥厚的基础及临床研究。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.09.007

R541.3

A

1671-8348(2017)09-1175-04

2016-08-24

2016-11-07)

论著·基础研究