SFRP2在抑制宫颈癌细胞株的增殖作用研究

兰 健，刘晓云，刘虹岚

(贵州省遵义市第一人民医院妇产科 563002)

SFRP2在抑制宫颈癌细胞株的增殖作用研究

兰 健，刘晓云△，刘虹岚

(贵州省遵义市第一人民医院妇产科 563002)

[摘要] 目的 了解SFRP2在人宫颈癌组织中的表达变化，探讨SFRP2对宫颈癌细胞增殖的影响。方法 采用Western bolt及qRT-PCR检测SFRP2在宫颈癌组织中的表达；用慢病毒构建过表达SFRP2的人宫颈癌细胞株，并用CCK-8及平板克隆分析SFRP2对细胞增殖的影响；Western bolt和qRT-PCR检测SFRP2在肿瘤细胞内对WNT通路的相关蛋白和基因表达的影响。结果 与癌旁组织相比，SFRP2在人宫颈癌组织中低表达；过表达SFRP2的宫颈癌细增殖受抑制；SFRP2抑制细胞增殖是通过WNT信号通路而发生。结论 SFRP2作为宫颈癌新的候选基因作用有待深入研究。

SFRP2；宫颈肿瘤；增殖；WNT信号通路

宫颈癌是目前病死率较高的一种女性生殖系统肿瘤，严重威胁妇女的生命和健康[1]。随着对宫颈癌的认识不断深入，诊疗方法发展，然而患者生存期仍不佳。因此，从分子水平探索宫颈癌的发生、发展机制，争取宫颈癌的早期诊治，对改善患者的预后有重要的意义。SFRP2基因属于编码SFRP家族的一个成员，其含有一个富含半胱氨酸的同源Frizzled蛋白，后者为公认的WNT结合位点[2]。SFRPs是一种WNT通路的抑制分子，可以负向调节WNT信号通路[3]，抑制许多肿瘤的增殖、侵袭转移及增加肿瘤的凋亡[4]。因此，作者推测在宫颈癌组织中SFRP2的表达也可能发生变化，并可能参与调控宫颈癌细胞的生物学行为。为验证上述假设，本研究拟在宫颈癌及癌旁组织中检测SFRP2的表达变化， 探索SFRP2对宫颈癌细胞增殖的影响及其机制，为临床提供宫颈癌治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 宫颈癌及癌旁组织来源于本院妇产科2015年1月至2015年6月切除的、初诊为原发性宫颈癌的住院患者4例，年龄55～70岁，平均年龄61岁，已获患者知情同意及本院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 HeLa和C-33A人宫颈癌细胞均购自中国科学院细胞库，使用DMEM培养基(GIBCO公司)，10%胎牛血清(FBS，GIBCO公司)。在37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养。取对数期生长良好的细胞进行实验。

1.2.2 细胞转染及稳转细胞系的构建 利用PCR的方法克隆人SFRP2的全长编码序列并构建表达载体pcDNA3.1-SFRP2。利用用慢病毒将表达载体及空载转入宫颈癌细胞株HeLa和C-33A。利用G418筛选单克隆细胞，建立SFRP2基因稳定高表达及空载体，并分别命名为Lv-SFRP2组(转染过表达SFRP2病毒的HeLa和C-33A细胞)，对照组(转染空载体的HeLa和C-33A细胞)及Blank组(未转染病毒的野生型HeLa和C-33A细胞)。

1.2.3 CCK-8细胞增殖检测 取2 000个/孔对数生长期的细胞接种于96孔培养板，设3个复孔，并设立空白对照。孵育0、24、48、72 h后，每孔加入CCK-8(日本同仁公司)，继续孵育1 h后，用自动酶标仪以450 nm波长检测各孔吸光度(A)值，取复孔吸光度平均值进行比较。为研究SFRP2对宫颈癌细胞增殖能力的影响，采用CCK-8法检测SFRP2正常表达与过表达时HeLa和C-33A细胞增殖能力的变化。

1.2.4 平板克隆形成检测细胞增殖 取对数生长期细胞，接种于6孔培养板中，每孔500个细胞。加入细胞的培养基，每组设3个复孔。然后将培养板移入37 ℃孵育箱中孵育12 d左右。4%多聚甲醛固定15 min，结晶紫染色10 min。显微镜下观察、拍照，并计算其克隆形成数(含50个细胞以上的集落为1个克隆)。

1.2.5 Western blot检测 细胞增殖汇合达80%时弃去培养基，冷PBS洗2遍，细胞直接刮下吸入1．5 mL无酶离心管，加入裂解液RIPA(提前加人终浓度为1 mmol/L的蛋白酶抑制剂PMSF)200 ixL，冰上裂解30 min后，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，吸取上清液至1.5 mL无酶离心管中，用BCA法做标准曲线测蛋白浓度，10%分离胶、5%浓缩胶进行电泳，湿转法转膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，一抗于4 ℃孵育过夜(SFRP2，total-β-catenin，c-myc和Cyclin D1抗体购买于Abcam公司，active-β-catenin抗体购买于Millipore公司)，TBST洗膜3次，二抗(1∶2 000)于室温孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL发光试剂发光。为阐明SFRP2对宫颈癌细胞增殖的作用机制。用Western blot检测宫颈癌细胞株(HeLa和C-33A)用过表达SFRP2时对WNT信号通路的变化、c-myc的变化及周期相关蛋白Cyclin D1的变化。

1.2.6 RT-PCR检测 用TRIzol法提取RNA(TRIzol购于Invitrogen公司)，反转录合成cDNA(反转录试剂盒primeScriptTMRT kit购于宝生物公司)，以其为模板，用SYBR premix Ex TaqTMGreen Ⅱ(购于Takara公司)在Real-time PCR系统上(BioRad,Hercules,CA,USA)检测靶基因的mRNA水平。c-myc引物(上游：5′-CCT GGT GCT CCA TGA GGA GAC-3′，下游：5′-CAG ACT CTG ACC TTT TGC CAG G-3′)Cyclin D1引物(上游：5′-TCT ACA CCG ACA ACT CCA TCC G-3′，下游：5′-TCT GGC ATT TTG GAG AGG AAG TG-3′)及内参β-actin的引物(上游：5′-CAC CAT TGG CAA TGA GCG GTT C-3′，下游：5′-AGG TCT TTG CGG ATG TCC ACG T-3′)。用qRT-PCR检测宫颈瘤细胞株(HeLa 和C-33A)过表达SFRP2时对c-myc和周期相关蛋白Cyclin D1的mRNA的变化。

2 结 果

2.1 SFRP2在宫颈癌组织及癌旁组织中的mRNA和蛋白表达水平比较 宫颈癌组织中SFRP2的mRNA和蛋白水平均较癌旁组织明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

A：SFRP2的mRNA表达；B：SFRP2的蛋白表达；P：癌旁组织；T：宫颈癌；a:P<0.05，与癌旁组织比较。

2.2 宫颈癌细胞株HeLa和C-33A中SFRP2的过表达效果鉴定 在宫颈癌组织中，SFRP2的mRNA及蛋白水平均低于癌旁组织。在HeLa和C-33A细胞中，相比于Blank组，对照组的SFRP2的mRNA和蛋白表达水平并无明显变化；而Lv-SFRP2组SFRP2的表达水平较Blank组及对照组细胞明显升高(P<0.05)，见图2。

2.3 CCK-8检测宫颈癌细胞株HeLa和C-33A中SFRP2的过表后增殖的影响 在4 d的培养中，Blank组和对照组的增殖能力并没有发生明显改变，但SFRP2过表达Lv-SFRP2组细胞增殖能力明显低于前两组，见图3。

2.4 平板克隆检测宫颈癌细胞株HeLa和C-33A中SFRP2的过表后增殖的影响 平板克隆形成实验检测SFRP2对宫颈癌细胞增殖能力的影响，结果显示，Blank组和对照组的增殖能力没有发生明显改变，而在SFRP2过表达的Lv-SFRP2组细胞增殖能力明显低于前两组，见图4。

A：转染病毒后HeLa 和C-33A细胞SFRP2的蛋白表达；B：转染病毒后HeLa 和C-33A细胞的mRNA表达；1：Blank组；2：对照组；3：Lv-SFRP2组；a：P<0.05，与Lv-SFRP2组比较。

a：P<0.05，与0、1 d比较。

1：Blank组；2：对照组；3：Lv-SFRP2组；a：P<0.05，与Lv-SFRP2组比较。

2.5 SFRP2对宫颈癌细胞的抑制作用 WNT信号被激活后，c-myc蛋白表达降低，Cyclin D1蛋白表达减少；c-myc和Cyclin D1的mRNA表达减少，见图5。

a-β-catenin：激活型的β-catenin;t-β-catenin：总的β-catenin;1：Blank组；2：对照组；3：Lv-SFRP2组；a：P<0.05，与Lv-SFRP2组比较。

3 讨 论

宫颈癌是全球女性恶性肿瘤中仅次于乳腺癌的恶性肿瘤[5]，严重危害女性健康。据统计，全世界每年有20多万妇女死于宫颈癌[6]。而宫颈癌的发生、发展是多因素共同作用下的结果，由于目前有关调控宫颈癌发生、发展的分子机制尚未完全阐明，用以指导临床的研究更为缺乏，所以中晚期宫颈癌的疗效不佳。因而，探讨宫颈癌发生、发展的分子机制，寻找宫颈癌治疗靶点，对于提高宫颈癌的疗效具较大的临床意义与社会价值。

SFRP2属于一种分泌型卷曲相关蛋白族组成的SFRPs，该家族主要成员包括SFRP1～5，均为WNT/β-catenin信号通路的抑制蛋白[7-8]。众所周知，WNT信号通路在肿瘤的发生、胚胎发育和神经退行性疾病均发挥着重要的作用[9]，并已被广泛的在人类癌症研究。 研究表明，WNT信号通路在非小细胞肺癌(NSCLC)[10]和白血病[11]等多种人类肿瘤中被异常激活。有研究报道，SFRP2可通过影响SLUG、TWIST和 SNAIL这3个参与上皮间质转化(EMT)的转录因子，从而增加上皮细胞的标志物E-cadherin的表达，最后抑制宫颈癌的侵袭转移[12]。Luo等[13]研究发现，在黑色素癌中SFRP2启动子发生甲基化，造成该基因表达降低，激活WNT通路；使用DNA甲基化抑制剂后，SFRP2表达增加，并可促进黑色素瘤的侵袭转移能力。此外，Xiao等[14]在口腔鳞状细胞癌中研究发现，SFRP2的mRNA水平较癌旁减少，同时，SFRP2启动子发生了超甲基化，通过激活WNT通路，增加了口腔鳞状细胞癌细胞的增殖能力。Yamamura等[15]在体外和体内研究中发现，减少肾肿瘤细胞的SFRP2表达可以明显促进肿瘤的生长；相反，稳定过表达SFRP2可以通过增加细胞G2期阶段的比例，抑制肿瘤的生长、诱导细胞产生凋亡。研究人员还发现，稳定过表达SFRP2的细胞系中，磷酸化β-catenin水平升高。同时可观察到c-fos，Bcl-2，Bcl-w、cyclin B2及细胞周期蛋白E2基因的表达增加与p53的表达下降；SFRP2激活WNT通路而引起的不同信号转导通路的改变，促进了肾癌细胞的生长。可见SFRP2可从多个角度，调控多种肿瘤的WNT通路活性，在肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。

目前SFRP2对宫颈癌细胞增殖的影响鲜见报道，为了初步探讨SFRP2在宫颈癌发生、发展中可能的重要作用，本研究用临床标本，检测了SFRP2的表达，发现在宫颈癌组织中SFRP2呈低表达状态；提示SFRP2异常表达很可能为促癌因子，参与宫颈癌的发生、发展过程。随后作者在体外部分的研究发现，通过CCK-8和平板克隆形成实验发现过表达SFRP2可以抑制宫颈癌的增殖能力，且SFRP2的这种效应与抑制WNT信号通路及其下游靶基因c-myc和Cyclin D1等基因和蛋白的表达水平密切相关。

综上所述，本研究首次发现了SFRP2参与宫颈癌发生、发展的可能机制，同时也加深了作者对SFRP2蛋白参与调控肿瘤生物学行为的认识，并为宫颈癌的诊断提供了方向，也为治疗宫颈癌新药的作用靶点提供了新的实验证据，值得进一步深入研究。

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Study on inhibition role of SFRP2 on cervical cancer cell line proliferation

LanJian，LiuXiaoyun△，LiuHonglan

(DepartmentofGynecologyandObstetrics,ZunyiMunicipalFirstPeople′sHospital,Zunyi,Guizhou563002,China)

[Abstract] Objective To understand the expression change of SFRP2 in human cervical cancer tissue and to investigate the effect of SFRP2 on cervical cancer cell proliferation.Methods The expression of SFRP2 in cervical cancer tissue was detected by using Western blot and qRT-PCR;the SFRP overexpressed human cervical cancer line was constructed by using lentivirus,the effect of SFRP2 on the proliferation of human cervical cancer cell line was analyzed by CCK-8 and plate cloning.The effect of SFRP2 on the expression of WNT pathway related proteins and genes in human cervical cancer cell was detected by Western Bolt and qRT-PCR.Results Compared with paracancerous tissue,SFRP2 was lowly expressed in human cervical cancer tissue;overexpressed SFRP2 cervical cancer cell proliferation was inhibited;SFRP2 inhibiting cellular proliferation was occurred via WNT signal pathway.Conclusion The role of SFRP2 as a candidate gene for cervical cancer remains to be deeply studied.

SFRP2；uterine cervical neoplasms；proliferation；WNT signaling pathway

兰健(1972-)，副主任医师，本科，主要从事妇科肿瘤的诊治研究。△

，E-mail:656479556@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.09.008

R246.3；R737.33；R73-3

A

1671-8348(2017)09-1179-03

2016-08-14

2016-11-28)

论著·基础研究