生附子煎煮过程中生物碱含量变化及水解机理

龚又明，邓广海，郑显辉，覃 军，罗明超，王 芳

（1．广东省中医院药学部，广东 广州 510120； 2．广东药科大学中药学院，广东 广州 510006）

·实验研究·

生附子煎煮过程中生物碱含量变化及水解机理

龚又明1，邓广海1，郑显辉1，覃 军1，罗明超1，王 芳2

（1．广东省中医院药学部，广东 广州 510120； 2．广东药科大学中药学院，广东 广州 510006）

目的观察生附子煎煮过程中生物碱成分含量的变化和水解，探索生附子煎煮减毒的机理。方法采用高效液相色谱（HPLC）法测定生附片煎煮前后7种成分的含量，比较其含量变化；采用新乌头碱、次乌头碱、乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱对照品模拟煎煮过程，考察不同温度和水解时间对6种单、双酯型生物碱含量的影响，观察酯型生物碱煎煮前后水解程度，分析其降解率和稳定性，并确定其水解产物。结果生附片煎煮前后含量测定HPLC图中确定8个色谱峰，生附片中3种双酯型生物碱总量为1．756 mg／g，3种单酯型生物碱总量为0．724 mg／g，煎煮1 h后，其含量分别为0．026 mg／g和1．961 mg／g；对照品水解试验HPLC图中确定10个色谱峰，新乌头碱、次乌头碱、乌头碱对照品50℃水解30 min，其降解率分别为18．72%，4．85%，28．91%，50℃水解1 h，其降解率分别为33．3%，6．99%，40．14%，100℃水解30 min以上，其降解率均为100．00%；苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱对照品50℃水解1 h后的含量基本不变，100℃水解1 h，其降解率分别为63．31%，42．36%，64．15%，100℃水解2 h以上，其降解率均为100．00%；根据对照品水解过程中的降解率大小，确定其稳定性大小依次为苯甲酰次乌头原碱＞苯甲酰新乌头原碱＞苯甲酰乌头原碱＞次乌头碱＞新乌头碱＞乌头碱。结论附子中双酯型生物碱在50℃下即发生水解，100℃下30 min可水解完全，单酯型生物碱在50℃下较稳定，100℃下2 h即可水解完全。生附片煎煮过程是一个溶出与降解的动态过程，煎煮1 h后双酯型生物碱基本消失。

生附子；生物碱；煎煮；水解规律；高效液相色谱

附子为毛茛科植物乌头 Aconitum carmichaelii Debx． 子根的加工品，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛的功效[1]，临床应用的附子有生、熟之分，如《伤寒论》中含附子经方有20方，其中生用者达7方[2－3]。2015年版《中国药典（一部）》附子项下仅收录了盐附子、黑顺片、白附片、炮附片和淡附片5个品种，生附子未收录其中[1]。一般认为，生附子毒性剧烈，经炮制减毒后方可入药，但附子炮制过程中毒性降低的同时，有效成分也流失严重，如黑顺片经过浸漂、煎煮蒸制等炮制程序，其生物碱流失70% ～80%[4－5]，严重影响临床疗效。生附子经过适量煎煮，不仅能保存附子有效成分，且其毒性成分含量也大大降低至与制附子相当[6－9]。陈平等[8]认为，长时间煎煮可明显降低双酯型生物碱和生物脂碱的浓度，是生附子煎煮减毒作用的主要理论依据。前期研究发现，生附子在煎煮过程中其酯型生物碱并非简单的转化过程，除了受饮片片型和浸泡时间的影响外，与温度和煎煮时间更是密切相关。本研究中对生附片煎煮前后7种成分的含量进行测定，分析其毒性成分和有效成分，同时以6种单、双生物碱对照品进行水解试验，考察不同温度和不同时间下酯型生物碱水解程度，确定其水解产物，从化学成分上探索附子中酯型生物碱的水解规律和生附子煎煮减毒增效机理。

1 仪器与试药

1．1 仪器

1200型系列高效液相色谱仪（Agilent科技有限公司）；240型十万分之一电子分析天平（德国赛多利斯集团）；HWS24型电热恒温水浴锅（上海一恒科技仪器有限公司）；DHG－9145A型电热恒温鼓风干燥箱（上海浦东荣丰科学仪器有限公司）。

1．2 试药

乌头碱、次乌头碱、新乌头碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号分别为 0720－9807，110798－200404，799－9403，纯度≥98%）；苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱对照品（成都瑞芬思生物有限公司，批号分别为 20141124，20141203，20140512，纯度≥98%）；苯甲酸对照品（广州番禺力强化工分厂，批号为20140821，纯度≥99．5%）；生附片（广州市药材公司，批号为YPA3C0001），均经广东省中医院药学部覃军副主任中药师鉴定为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx．子根的炮制品。四氢呋喃、乙腈为色谱纯（德国Merck公司）；甲醇、盐酸等试剂均为分析纯（广州化学试剂厂），水为超纯水。

2 方法与结果

2．1 色谱条件[10]

色谱柱：迪马Kromasil C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流动相：以乙腈－四氢呋喃（25∶15）为流动相A，以0．1 mol／L醋酸铵（每1 000 mL溶液中加入醋酸溶液0．5 mL）为流动性B，梯度洗脱（0～15 min，16% ～19%A；15～45 min，19%～22%A；45～60 min，22%～35% A；60～75 min，35%A）；柱温：30℃；流速：0．8 mL／min；波长：235 nm；进样量：10 μL。

2．2 溶液制备

2．2．1 对照品溶液

称取对照品适量，精密称定，置100 mL容量瓶中，用0．05%HCl－甲醇溶解并定容至刻度，配成苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱、苯甲酸（质量浓度分别为40．2，30．4，31．9，23．7，16．1，20．4，39．3 μg／mL）的混合对照品溶液。

2．2．2 供试品溶液

样品供试品溶液：取生附片样品粉末（过3号筛）1．0 g，精密称定，置50 mL锥形瓶中，精密移取异丙醇∶乙酸乙酯（1∶1）混合溶液50 mL，氨试液3 mL，摇匀，静置，称定质量，放置过夜，连续超声（功率250 W，频率40 kHz）0．5 h，冷却至室温，再称定质量，用异丙醇∶乙酸乙酯（1∶1）混合溶液补足减失的质量，过滤，摇匀，精密吸取续滤液25 mL，于38℃减压回收溶剂至干，精密吸取甲醇（含0．05%HCl）溶液5 mL溶解，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

煎煮液供试品溶液：称取生附片样品30 g，置500 mL圆底烧瓶中，加水300 mL，先浸泡30 min，100℃水浴加热1 h，纱布滤过，药渣加水240 mL，100℃水浴加热0．5 h，纱布滤过，合并2次滤液，65℃减压浓缩定容至300 mL，摇匀，精密移取4 mL，以3 000 r／min的速率离心10 min，将上清液加至已处理好的C18固相萃取小柱上（5 mL甲醇活化，4 mL水平衡），待其完全通过后，先用5 mL水洗涤，再用5 mL甲醇洗脱，整个洗脱过程控制流速约为0．5 mL／min。收集甲醇洗脱液，38℃减压回收蒸干，精密吸取甲醇（含0．05%HCl）溶液1 mL溶解残渣，滤过，即得。

水解试验供试品溶液：分别精密称取苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱对照品适量，用微量甲醇超声溶解，然后用超纯水定容至刻度，摇匀，分别配制成质量浓度为0．062，0．058，0．062，0．067，0．054，0．064 g／L的对照品溶液，分别精密移取1．5 mL，置5 mL容量瓶中，超纯水定容至刻度，摇匀，反复操作5次。其中3种双酯型生物碱分别于恒温烘箱中0 h，50℃水解30 min，50℃水解1 h，100℃水解30 min，100℃水解1 h；3种单酯型生物碱分别于恒温烘箱中0 h，50℃水解1 h，100℃水解1 h，100℃水解2 h，100℃水解3 h，放入冰浴中停止反应，冷却至室温后，用超纯水补足至刻度，摇匀，即得。

表1 线性关系考察结果

2．3 方法学考察

标准曲线绘制：精密吸取混合对照品溶液适量，注入液相色谱仪，测定6种生物碱和苯甲酸的峰面积。结果以峰面积（Y）对质量浓度（X）进行线性回归，得标准曲线、线性范围及相关系数（R2）。结果见表1。

精密度试验：精密吸取混合对照品溶液适量，采用拟订色谱条件进样，重复测定5次。结果苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱和苯甲酸峰面积的 RSD分别为0．45%，0．66%，0．47%，0．68%，0．89%，0．58%，1．02%(n＝5)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一批生附片粉末（过3号筛）适量，按2．2项下方法制备供试品溶液，采用拟订色谱条件，分别于0，4，8，16，24 h时各进样10 μL。结果苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱和苯甲酸峰面积的 RSD分别为1．42%，1．06%，1．31%，1．26%，1．24%，1．07%，1．52%(n＝5)，表明供试品溶液在24 h内稳定。

重复性试验：取同一批生附片粉末（过3号筛）适量，按2．2项下方法制备供试品溶液，进行提取，采用拟订色谱条件，分别进样10 μL，重复操作5次，由标准曲线计算含量。结果苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱和苯甲酸含量的 RSD分别为 1．33%，1．05%，1．28%，1．02%，1．08%，1．24%，1．56%(n＝5)，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取同一批已知含量的生附片粉末（过3号筛），精密称定，按2．2项下方法制备供试品，进行提取，提取液中加入7种对照品适量，依法进行测定。结果苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、次乌头碱、乌头碱和苯甲酸的平均回收率分别为105．01%，102．62%，104．28%，99．43%，97．54%，98．69%，96．37%，RSD分别为 2．34%， 2．77%，3．02%，2．82%，2．99%，3．05%，3．12%。

2．4 样品含量测定

精密吸取上述供试品溶液适量，按上述含量测定方法进行分析，测定6种生物碱和苯甲酸的含量。

2．5 水解机理探讨

2．5．1 测定指标

在单个酯型生物碱的水解试验中，本试验中考察了温度和水解时间对其含量及水解产物含量的影响，并计算其降解率（%）和转化率（%）。

降解率（%）＝（水解前样品含量－水解后样品含量）／水解前样品含量×100%。

转化率（%）＝水解后样品含量／完全水解后样品含量×100%。

2．5．2 色谱峰确定和含量测定结果

由图 1可见，3种酯型生物碱混合对照品水解液HPLC图发现10个色谱峰（1～10号峰），与混合对照品溶液色谱图比较，可鉴定1～4号峰分别为苯甲酸（benzoic acid， BA）， 苯 甲 酰 新 乌 头 原 碱（benzoylmesaconine，BMC），苯 甲 酰 乌 头 原 碱（benzoylaconine，BAC），苯 甲 酰 次 乌 头 原 碱（benzoylhypaconine，BHC），8～10号峰分别为新乌头碱（mesaconitine，MAC），次乌头碱（hypaconitine，HAC），乌头碱（aconine，AC）。根据新乌头碱、次乌头碱和乌头碱单一对照品水解液的HPLC分析结果，参考文献[11－12]，可确认 5～7号峰分别为焦新乌头碱（pymesaconitine，PMC），焦乌头碱（pyraconitine，PAC），焦次乌头碱（pyrhypaconitine，PHC）。

经测定，生附片中新乌头碱、次乌头碱、乌头碱、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱的含量分别为 0．584，0．195，0．977，0．314，0．082，0．328 mg／g。经常规煎煮后，其煎煮液中苯甲酰新乌头碱、苯甲酰次乌头碱、苯甲酰乌头碱、次乌头原碱的含量分别0．704，0．183 3，1．074，0．026 mg／g，苯甲酸含量为0．061 mg／g，新乌头碱和乌头碱含量未测得。可见，生附片不含焦乌头碱类，主要含有双酯型生物碱，经过煎煮后转化为焦乌头碱或单酯型生物碱，部分进一步转化为醇胺型生物碱和苯甲酸。

图1 混合对照品、3种双酯型生物碱水解液和生附片煎煮前后高效液相色谱图

2．5．2 水解试验结果

由图2可见，生附子中双酯型生物碱在水和一定温度下，可水解为单酯型生物碱，其中焦头碱类是双酯转化为单酯生物碱的中间产物，性质不稳定，而单酯型生物碱进一步水解为醇胺型生物碱和苯甲酸，而醇胺型生物碱无紫外吸收，未测得。

由表2至表7可见，3个双酯型生物碱在50℃的水溶液即发生一系列水解反应，新乌头碱、次乌头碱、乌头碱对照品 50℃水解 30 min，其降解率分别为18．72%，4．85%，28．91%，50℃水解1 h，其降解率分别为33．3%，6．99%，40．14%，100℃水解30 min以上，其降解率均为100．00%；苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰乌头原碱对照品50℃水解1 h，其含量基本不变，100℃水解 1 h，其降解率分别为63．31%，42．36%，64．15%，100℃水解2 h以上，其降解率均为100．00%。根据酯型生物碱对照品水解过程中的降解率，其稳定性大小依次为苯甲酰次乌头原碱＞苯甲酰新乌头原碱＞苯甲酰乌头原碱＞次乌头碱＞新乌头碱＞乌头碱。结果见表2至表7及图2。

3 讨论

现代研究表明，附子主要含有水溶性和脂溶性生物碱类成分，脂溶性生物碱以C－19型二萜生物碱为主，具有强心、抗炎、镇痛等作用，同时毒性剧烈，在水和加热情况下可水解为毒性较低单酯型生物碱，而疗效仍存；水溶性生物碱如 Higenamine，Coryneine，Chloride，Salsolinol，Uracil等，具有较强的强心作用[13]，其性质稳定，随着煎煮时间的延长，其含量逐渐增加[8]，因此控制好单、双酯型生物碱在煎煮过程中的水解程度是保证附子临床安全性和有效性的关键。而生附子在煎煮过程中其酯型生物碱并不是简单的转化过程，除了受饮片片型和浸泡时间的影响外，与温度和煎煮时间也密切相关。本研究中选择了50℃和100℃ 2个温度，50℃下双酯型生物碱即可发生水解反应，100℃为常规煎煮温度，单、双酯型生物碱在该温度下均可发生水解反应，选择了0．5，1，2，3 h 4个时间，在该时间段下，可跟踪酯型生物碱水解发生到完全水解的整个过程。

图2 6种单、双酯型生物碱对照品水解高效液相色谱图

表2 新乌头碱对照品水解液含量测定结果

表3 苯甲酰新乌头原碱对照品水解液含量测定结果

表4 次乌头碱对照品水解液含量测定结果

表5 苯甲酰次乌头原碱对照品水解液含量测定结果

表6 乌头碱对照品水解液含量测定结果

表7 苯甲酰乌头原碱对照品水解液含量测定结果

匡海学[14]在《中药化学》中论述，乌头碱在100℃水解生成苯甲酰乌头碱，在160～170℃生成乌头原碱。然而试验发现，双酯型生物碱在50℃条件下即发生水解反应，首先转化为焦乌头碱类，即水解中间产物，然后进一步转化为单酯型生物碱，而单酯型生物碱稳定性较好，在100℃条件下可发生水解反应，转化为醇胺型生物碱（即乌头原碱）和苯甲酸，2 h即可水解完全。根据6种酯型生物碱对照水解试验中的降解率大小，发现其稳定性大小依次为苯甲酰次乌头原碱＞苯甲酰新乌头原碱＞苯甲酰乌头原碱＞次乌头碱＞新乌头碱＞乌头碱。该结论与生附片煎煮试验结果一致，生附子煎煮过程是一个溶出和水解的动态过程，在100℃水溶液的煎煮过程中，一部分双酯型生物碱在饮片内部发生水解反应，一部分逐渐溶出到水溶液中，再发生水解反应，一方面由于生附片中次乌头碱含量最高，导致其溶出量也高，另一方面次乌头碱性质较新乌头碱和乌头碱稳定，其降解率低，使得生附子煎煮1 h后还存留微量次乌头碱，而不含新乌头碱和乌头碱。

根据生附子中酯型生物碱性质及其煎煮过程中的水解机理，生附子通过合理的煎煮，既能极大地保留其有效成分，也能降低其毒性，使之在临床安全范围。临床中生附子使用剂量也不是越大越好，虽然通过煎煮可使附子中双酯型生物碱转化为单酯型生物碱，毒性降低，但是剂量过大易导致单酯型生物碱累积，而单酯型生物碱服用剂量过大也易引起中毒。因此，临床医师必须辨证论治，确定附子合适的剂量。同时，生附子煎煮时间的确定，除了与附子片型、浸泡时间有关外，也跟附子生物碱种类和含量高低相关，需要对其影响因素进行综合评价才能确定最佳的煎煮时间。

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Study on the Content of Alkaloid and the Raw of Hydrolysis of Radix Aconite Lateralis during Decocting Process

Gong Youming1，Deng Guanghai1，Zheng Xianhui1，Qin Jun1，Luo Mingchao1，Wang Fang2
（1．Department of Pharmaceutical，GuangdongProvincial Hospital of TCM，Guangzhou，Guangdong，China 510120； 2．School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou，Guangdong，China 510006）

Objective To observe the content of alkaloid of Radix Aconite Lateralis and the raw of hydrolysis，and toxicity reducing mechanism during decocting process．M ethods HPLC method was used to determine the content of seven components before and after decocting and compare the change of content；the boiling process was simulated，the degradation rate and stability of mesaconitine，hypaconitine，aconine，benzoylmesaconine，benzoylaconine，ben－zoylhypaconine were observed in different temperature and time，the degree of hydrolysis of ester－type alkaloids before and after decocting was observed，and the hydrolysate was determined．Results Eight peaks were identified in the HPLC chromatogram of Radix Aconite Lateralis before and after decocting；the total content of three digester alkaloids was 1．756 mg／g，and the total content of three kinds of monoester alkaloids was 0．724 mg／g，after boiling 1 h，those content were 0．026 mg／g and 1．961 mg／g；ten peaks were identified in the HPLC chromatogram of hydrolysis test of reference product，the degradation rate of mesaconitine，hypaconitine，aconitine when hydrolyzing 30 min at 50℃ were 18．72%，4．85% and 28．91% respectively，the degradation rate of them when hydrolyzing 1 h in 50℃ respectively，the degradation rate was 100．00% for 30 min or more in 100℃；the content of benzoylmesaconine，benzoylhypaconine，benzoylaconine when hydrolyzing 1 h in 50℃ were the same basically，the degradation rate of them when hydrolyzing 1 h in 100℃ were 63．31%，42．36%，64．15% respectively，the degradation rate was 100．00% when hydrolyzing 2 h or more in 100℃；according to the degradation rate of the reference substance，the results were evaluated as follows benzoylhypaconine＞benzoylmesaconine＞benzoylaconine＞hypaconine＞mesaconine＞aconine．Conclusion The diester－type alkaloids could be hydrolyzed at 50℃ and be hydrolyzable at 100℃ for 30 min，the monoester－type alkaloid is stable at 50℃ and could be hydrolyzed at 100℃ for 2 h；the decocting process was a dynamic process of dissolution and degradation，and the content of the digester－type alkaloid disappears after decocting for 1 h．

radix aconite lateralis；alkaloid；decocting；hydrolysis；HPLC

R282．4；R282．71

A

1006－4931(2017)04－0009－07

2016－11－05)

10．3969／j．issn．1006－4931．2017．04．003

广东省科技计划项目[2016A040403104，20160403]。

龚又明，男，硕士研究生，主管中药师，研究方向为中药炮制与鉴定，（电话）020－81887233（电子信箱）4896318＠qq．com。

王芳，女，博士研究生，讲师，研究方向为中药学，（电话）020－39352169（电子信箱）fangzisunny＠126．com。