川麦冬高效液相色谱指纹图谱研究

郭明里，张加余，王 冰，李 宁，，董婷霞，詹华强，屠鹏飞

（1．香港科技大学深圳研究院，广东 深圳 518057； 2．北京中医药大学科研实验中心，北京 100029；3．上海中医药大学教学实验中心，上海 201203； 4．北京大学医学部药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 100191）

·实验研究·

川麦冬高效液相色谱指纹图谱研究

郭明里1，张加余2，王 冰3，李 宁1，4，董婷霞1，詹华强1，屠鹏飞4

（1．香港科技大学深圳研究院，广东 深圳 518057； 2．北京中医药大学科研实验中心，北京 100029；3．上海中医药大学教学实验中心，上海 201203； 4．北京大学医学部药学院天然药物及仿生药物国家重点实验室，北京 100191）

目的建立一种新的川麦冬高效液相色谱（HPLC）指纹图谱分析方法。方法以HPLC法对10批川麦冬药材的指纹图谱进行分析，采用8个对照品对部分共有峰进行指认，利用相似度分析、相对保留时间及相对峰面积分析进一步对指纹图谱进行分析。结果10批川麦冬药材的相似度均大于0．900，各批次药材共有峰的相对峰面积在较宽范围内波动，RSD＝7．1% ～71．9%(n＝10）。结论该方法简便、实用，便于工业化生产，可用于麦冬药材的质量评价。

麦冬；高效液相色谱；指纹图谱；质量评价

麦冬为百合科（Liliaceae）沿阶草属（Ophiopogon）植物麦冬 Ophiopogon japonicus（L．f．）Ker－Gawl．的干燥块根，具有养阴生津、润肺清心之功效，用于肺燥干咳、阴虚痨嗽、喉痹咽痛、津伤口渴、内热消渴、心烦失眠、肠燥便秘等症[1]。麦冬为常用中药，用药历史悠久，《神农本草经》始载并将其列为上品，历代重要本草均有记载，亦为《中国药典》所收载。麦冬的传统主产地为浙江和四川两省，分别称之为浙（杭）麦冬和川麦冬。浙（杭）麦冬主产于杭州东南慈溪、萧山等地，生产周期通常为2～3年，栽培面积及产量随市场行情波动较大。川麦冬集中栽培于四川省绵阳市三台县等地，其栽培期仅1年，具有生长期短、产量高的特点，曾为我国最大的麦冬产地[2]。目前，川麦冬是市场主流的麦冬商品药材。

麦冬含有甾体皂苷、高异黄酮、多糖及其他多种类型的化学成分[3]。有关川麦冬的质量评价方法，近年来学者们从多成分含量测定[4－7]、指纹图谱[8－9]、有害物质检测[4，10]等诸多方面开展了研究。前期研究报道，对川麦冬的化学成分进行了较系统的研究，并从中分离鉴定了一系列甾体皂苷及高异黄酮类化合物[11－12]。在此基础上，采用高效液相色谱－紫外光－蒸发光散射器检测（HPLC－UV－ELSD）法建立了一种麦冬化学指纹图谱的分析方法，结合相似度分析、聚类分析、主成分分析等方法可实现川麦冬和浙（杭）麦冬的区分鉴别[9]。该方法侧重于综合运用多种化学计量学算法，对不同产地药材进行真实性鉴定。

中药注射剂是在口服方剂基础上发展起来的现代新剂型，它改变了传统的给药方式，有效成分经提取精制后直接进入人体，不仅保留了中医药传统的治疗特色，也具备化学药生物利用度高、起效迅速的优势[13]。目前，麦冬已广泛用于中药注射剂的生产，代表性品种参麦注射液已列入国家基本药物目录。据统计，2015年参麦注射液在全国城市公立医院中成药市场份额排名中位于第13位，在全国县级公立医院中成药市场份额排名中居第7位，是临床常用的中药注射剂大品种[14－15]。随着社会发展和人民生活水平的提高，人们对麦冬相关的中药注射液的安全性、有效性和可控性提出了更高要求。国家食品药品监督管理总局将参麦注射液列为中药注射剂安全性再评价的首批评价品种[16]。中药注射剂的质量与药材质量密切相关，研究中药成分从药材到制剂的质量传递规律，针对主要移行成分开发适用于工业生产的指纹图谱分析方法，以此对药材质量进行控制，对于提高制剂质量具有重要意义。因此，在前期研究基础上，本研究中对川麦冬的指纹图谱进行了进一步研究，建立了新的分析方法。

1 仪器与试药

1．1 仪器

1200型高效液相色谱仪，配置四元泵、在线脱气机、柱温箱、自动进样器（美国Agilent公司）；BP221S型分析天平（德国Sartorius公司）；Sedere Sedex 75型蒸发光散射检测器（ELSD，法国Sedere公司）；R210型旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）；Bransonic 2510E－MTH型超声波清洗机（美国Branson公司）。

1．2 试药

龙脑－2－O－β－D－呋喃芹糖基－（1→6）－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－1），麦冬皂苷元 －3－O－α－L－吡喃鼠李糖基－（1→2）－[β－D－吡喃木糖基－（1→4）]－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－2），麦冬皂苷元－3－O－α－L－吡喃鼠李糖基－（1→2）－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－3）、偏诺皂苷元－3－O－α－L－吡喃鼠李糖基 －（1→2）－[β－D－吡喃木糖基－（1→4）]－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－4），14－羟基薯蓣皂苷元－3－O－α－L－吡喃鼠李糖基－（1→2）－[β－D－吡喃木糖基－（1→4）]－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－5），14－羟基薯蓣皂苷元－3－O－α－L－吡喃鼠李糖基－（1→2）－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－6）、麦冬皂苷 D（S－7）和薯蓣皂苷元－3－O－α－L－吡喃鼠李糖基－（1→2）－[β－D－吡喃木糖基－（1→4）]－β－D－吡喃葡萄糖苷（S－8），共8个对照品均为自制，其结构经质谱、1HNMR及13C－NMR确证，纯度经HPLC－ELSD峰面积归一化法检测不低于98%；乙腈（德国默克股份两合公司）为色谱纯；甲醇（德国默克股份两合公司）为色谱纯；试验用水为超纯水；其余试剂均为分析纯；C18固相萃取柱（500 mg／4 mL，Alltech公司）。10批麦冬药材，编号分别为 OJ－1～OJ－10（产地均为四川省，2014年12月购于成都荷花池中药材专业市场）。所有样品均经李宁博士鉴定，标本保存于香港科技大学深圳研究院。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：Agilent SB－C18柱（250 mm×4．6 mm，5 μm）；流动相：以乙腈－甲醇（3∶1）为流动相A，以水为流动相 B，进行梯度洗脱（0～10 min，30%A；10～25 min，30% ～48%A；25～45 min，48%A；45～50 min，48% ～55%A；50～65 min，55% ～65%A；65～85 min，65% ～100%A；85～100 min，100%A）；流速：1 mL／min；柱温：30℃；蒸发光散射检测器检测漂移管温度：40℃，气体压力：2．5 bar；进样量：20 μL。

2．2 溶液制备

对照品溶液：称取对照品S－1、S－2、S－3、S－4、S－5、S－6、S－7、S－8适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL分别含上述对照品 0．10，0．05，0．10，0．05，0．10，0．05，0．05，0．05 mg的混合对照品溶液，即得。

供试品溶液：取麦冬药材粉末约2．0 g，精密称定，置100 mL三角瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，摇匀，密封，超声提取30 min（功率100 W，频率40 kHz），滤过，滤液50℃减压蒸干。残渣用5 mL水溶解，过固相萃取柱，依次用水、40%甲醇、甲醇各5 mL洗脱，收集甲醇洗脱部分，50℃减压浓缩，转移至1 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0．45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2．3 方法学考察

精密度试验：取同一批（批号为OJ－5）样品，按2．2项下方法制备供试品溶液，按照2．1项下色谱条件进样，测定6次，将所得色谱图输入国家药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012．130723版，以下简称相似度评价软件）进行相似度比较，采用中位数法生成参照指纹图谱，以参照指纹图谱计算各色谱图的相似度。结果各色谱图的相似度均大于0．980，且RSD＜0．5%(n＝6)，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批（批号为OJ－5）样品，按2．2项下方法制备供试品溶液6份，按2．1项下色谱条件进样分析，将所得色谱图输入相似度评价软件进行相似度比较，采用中位数法生成参照指纹图谱，以参照指纹图谱计算各色谱图的相似度。结果各色谱图的相似度均大于0．980，且 RSD＜0．5%(n＝6)，表明该方法重复性良好。

稳定性试验：取同一批（批号为OJ－5）样品，按2．2项下方法制备供试品溶液，分别于制备后0，3，6，9，12，24 h时按2．1项下色谱条件进样分析，将所得色谱图输入相似度评价软件进行相似度比较，采用中位数法生成参照指纹图谱，以参照指纹图谱计算各色谱图的相似度。结果各色谱图的相似度均大于 0．980，且 RSD＜0．5%(n＝6)，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2．4 分析与评价

2．4．1 川麦冬药材样品指纹图谱的测定

取10批川麦冬样品（批号为OJ－1～OJ－ 10），按 2．2项下方法制备供试品溶液，按 2．1项下色谱条件进样分析，得10批川麦冬药材指纹图谱(图1)。

图1 10批川麦冬药材的指纹图谱

图2 10批川麦冬药材指纹图谱的共有模式

图3 对照品溶液色谱图

2．4．2 共有模式指纹图谱的建立与共有峰指认

将所得的10批川麦冬药材色谱图导入相似度评价软件，采用中位数法生成共有模式，得到的共有模式（图2）包含共有峰40个。通过与对照品溶液色谱图（图3）对照保留时间，指认了其中8个色谱峰，峰4，13，14， 15，16，18，28和29分别为化合物S－1，S－2，S－3，S－4，S－5，S－6，S－7和S－8。

2．4．3 指纹图谱的相似度分析

因川麦冬药材色谱图中保留时间8 min之前的色谱峰及38号峰占总峰面积比例较大，对整体相似度影响过大。所有色谱图剪除8 min之前的色谱峰及38号峰重新生成共有模式，以该共有模式为参照，计算各色谱图的相似度。10批川麦冬药材的指纹图谱相似度按批号 OJ－1～OJ－10的顺序分别为 0．950，0．971，0．954，0．974，0．981，0．968，0．943，0．946，0．934，0．951。

表1 共有模式各色谱峰的保留时间、相对保留时间及10批药材各共有峰的相对峰面积

2．4．4 指纹图谱相对保留时间及相对峰面积分析

以28号峰麦冬皂苷D为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。10批药材共有峰的相对保留时间较固定，与共有模式对应峰的相对保留时间非常接近（RSD＜0．5%）。共有模式各色谱峰的相对保留时间及10批药材共有峰的相对峰面积见表1。

3 讨论

前期研究结果显示，已对供试品溶液的制备方法及色谱条件进行过大量的调整优化[9]。本研究中在前期研究的基础上建立了川麦冬药材指纹图谱新的分析方法，具有如下特点。

药材提取溶剂：由甲醇变为50%甲醇，使指纹图谱包含了更多大极性成分的信息（如峰1～12）。对于部分麦冬相关的制剂，特别是麦冬相关的注射剂，这些成分因水溶性较好，往往伴随工艺过程转移至最终产品。此外，本研究中对流动相梯度进行了调整，使指纹图谱同时包含了更多小极性成分的信息（如峰36～40）。这些成分占总峰面积的比例相对较大，含量较高，可转移至最终制剂，其物质基础有待进一步研究明确。对于保留时间8 min之前的色谱峰，因极性过大，保留时间过短，建议采取其他技术和方法建立多张指纹图谱，以综合评价药材质量。

检测器：由UV－ELSD串联变为单ELSD。UV检测器主要针对川麦冬中的高异黄酮类化合物。对于部分麦冬相关制剂，特别是麦冬相关的注射剂，高异黄酮类化合物因极性小、水溶性低，转移率往往较低。因此，本研究中采用单ELSD检测，降低仪器要求，减少分析测试成本。此外，本研究中采用国家药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统对数据进行分析，方法相对简便，不涉及复杂的化学计量学算法及特殊的软件。本研究中建立的分析方法具有较强的实用性，有利于医药工业行业实际应用。

评价：本研究中采用相似度分析和相对保留时间及相对峰面积分析对指纹图谱进行了评价。10批川麦冬药材的相似度均大于0．900，表明指纹图谱整体有良好的相似性。川麦冬药材有悠久的药用及栽培历史，良好的相似性显示药材质量相对稳定。相对峰面积反映了各色谱峰的比例关系，进而更加细致地反映药材的内在质量。在本研究中，各批次药材共有峰的相对峰面积在较宽的范围内波动（RSD＝7．1% ～71．9%），客观反映了不同批次药材成分比例的差异。因此，建议针对制剂的具体情况，利用本研究建立的分析方法研究各色谱峰从药材到制剂的质量传递规律，对主要移行成分和关键色谱峰的相对峰面积进行规定，制订合理的上下限。

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）[M]．北京：中国医药科技出版社，2015：155－156．

[2]余伯阳，徐国钧 ．中药麦冬的资源利用研究[J]．中草药，1995，26（4）：205－210．

[3]Chen MH，Chen XJ，Wang M，et al．Ophiopogon japonicus— A phytochemical，ethnomedicinal and pharmacological review[J]．J Ethnopharmacol，2016，181：193－213．

[4]吴发明，杨海燕，杨瑞山，等．四川麦冬质量评价研究[J]．中药材，2016，39（8）：1804－1809．

[5]吴发明，张思荻，曾 俊，等．HPLC－ELSD法测定不同产地麦冬中4种代表性成分的含量[J]．药物分析杂志，2016，36（8）：1370－1376．

[6]童菊华，庞小存，王 威，等．杭麦冬与川麦冬中高异黄酮类成分和抗氧化活性的比较[J]．中草药，2015，46（20）：3091－3095．

[7]刘 雪，杨会芳，李德坤，等．HPLC－ELSD法测定不同产地麦冬及山麦冬中的果糖[J]．中成药，2016，38（4）：850－853．

[8]王 进，刘汉清，刘 霖，等．HPLC定量指纹图谱法评价川麦冬质量研究[J]．中药材，2013，36（5）：721－725．

[9]李 宁，车彦云，张 梁，等．HPLC－UV－ELSD结合化学计量学方法研究麦冬的指纹图谱（英文）[J]．中国药学：英文版，2013，22（1）：55－63．

[10]吴发明，张德林，陈 辉，等 ．川麦冬药材中二氧化硫来源及残留积累动态分析[J]．中国实验方剂学杂志，2016，22（9）：12－15．

[11]Li N，Zhang L，Zeng KW，et al．Cytotoxic steroidal saponins from Ophiopogon japonicus[J]．Steroids，2013，78（1）：1－7．

[12]Li N，Zhang JY，Zeng KW，et al．Anti－inflammatory homoisoflavonoids from the tuberous roots of Ophiopogon japonicus[J]．Fitoterapia，2012，83（6）：1042－1045．

[13]聂黎行，石上梅，翟为民，等．指纹图谱技术在中药注射剂标准提高中的应用[J]．中成药，2015，37（3）：607－611．

[14]米内网．2015年度中国医药市场发展蓝皮书——公立医院终端市场部分（Ⅱ）[J]．药学进展，2015，39（7）：501－513．

[15]米内网．2015年度中国医药市场发展蓝皮书——公立医院终端市场部分（Ⅲ）[J]．药学进展，2015，39（8）：608－622．

[16]李鸿彬，李认书．对上市中成药再评价制度的回顾与思考[J]．中草药，2015，46（2）：293－296．

HPLC Fingerprint Analysis of Ophiopogonis Radix Cultivated in Sichuan

Guo Mingli1，Zhang Jiayu2，Wang Bing3，Li Ning1，4，Dong Tingxia1，Zhan Huaqiang1，Tu Pengfei4
（1．HKUST Shenzhen Research Institute，Shenzhen，Guangdong，China 518057； 2．Center of Scientific Experiment，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing，China 100029； 3．Experiment Center for Teaching and Learning，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai，China 201203；4．State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs，School of Pharmaceutical Sciences，Peking University Health Science Center，Beijing，China 100191）

Objective To develop a new HPLC method to generate the fingerprint of OphiopogonisRadix cultivated in Sichuan province．M ethods A total of 10 batches ofOphiopogonis Radix samples were analyzed by HPLC，and 8 reference substances were used forthe identification of the common peaks．The fingerprint was further analyzed by similarityanalysis，relativeretention time analysis and relative peak area analysis．Results The similarities of all the samples tested were higher than 0．900．The relative peak areas of the common peaks varied in a relatively wide range（RSD＝7．1% －71．9%，n＝10）．Conclusion The method is simple，practical，suitable for industrial application，and could be used for the quality evaluation of Ophiopogonis Radix．

Ophiopogonis Radix；HPLC；fingerprint；quality evaluation

R282．71；R284．1

A

1006－4931(2017)04－0001－05

2016－11－09)

10．3969／j．issn．1006－4931．2017．04．001

国家自然科学基金[81303189，81303206]。

郭明里（1991－），女，在读硕士研究生，研究方向为药学与药物分析，（电子信箱）gml53252811473272＠163．com。

李宁（1982－），男，博士研究生，研究方向为天然药物活性成分与质量评价，（电子信箱）mailtolining＠gmail．com。