超声辅助法提取酸枣仁中异牡荆素—吡喃葡萄糖苷工艺优化

宫 丽 刘 莹 杨婷婷 王 轻 张彦青

(天津商业大学生物技术与食品科学学院，天津 300134)

酸枣仁是中国常用药食同源品种之一[1-2]，在酸枣仁汤、枣仁安神方等肝血不足之失眠类的方剂、中成药处方、食品和保健食品中被广泛应用[3-4]。酸枣仁黄酮是酸枣仁中的主要活性成分之一[5-7]，具有治疗失眠[8]、改善认知能力[9-10]、抗焦虑[11]、抗抑郁[12-15]等多种生物活性，其中，异牡荆素—吡喃葡萄糖苷是酸枣仁黄酮的主要成分之一。异牡荆素—吡喃葡萄糖苷能够明显促进淋巴细胞増殖，具有一定的免疫调节作用[16]，在清除ABTS自由基、DPPH自由基、超氧阴离子自由基等方面表现出较好的抗氧化活性[17]。此外，异牡荆素—吡喃葡萄糖苷的吸收特性优于酸枣仁中的其他黄酮类物质，如斯皮诺素、当药素等[18]，显示出较好的体内生物利用度特性。

目前黄酮类化合物的常见提取方法主要为浸提法、加热回流法、超声辅助提取等，由于浸提法耗时太长，加热回流法又可能因为高温破坏黄酮类化合物的结构[19-20]，所以超声辅助提取技术受到越来越多的关注。超声辅助提取法利用超声传播时所产生的机械效应、空化效应和热效应[21]，可以缩短提取时间，降低操作难度并且增加提取率[22-23]。乙醇加热回流是当前提取异牡荆素—吡喃葡萄糖苷的主要方法[17]，目前有关超声波辅助提取酸枣仁中异牡荆素—吡喃葡萄糖苷的研究尚未见报道。研究拟通过超声辅助提取技术对酸枣仁黄酮单体异牡荆素—吡喃葡萄糖苷进行提取，并运用响应面法优化其提取工艺参数，以期为异牡荆素—吡喃葡萄糖苷的深入开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

脱脂酸枣仁：天津蓟县；

异牡荆素—吡喃葡萄糖苷对照品：纯度>95%，自制；

甲酸：色谱纯，阿拉丁控股集团有限公司；

乙腈：色谱纯，德国Merck公司；

水：色谱纯，美国J. T. Baker公司；

乙醇：分析纯，美国J. T. Baker Chemicals公司。

1.1.2 主要仪器设备

数控超声波清洗器：SB25-12 DTD型，宁波新芝生物科技有限公司；

高速万能粉碎机：FW100型，天津泰斯特仪器有限公司；

高速离心机：LG10-2.4A型，北京医用离心机厂；

电热恒温鼓风干燥箱：DH-101型，天津市中环实验电炉有限公司；

高效液相色谱仪：安捷伦1100型，安捷伦科技中国有限公司；

电子天平：FA1004Max 100 g 型，上海精科天平有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率测定

(1) 高效液相色谱条件：选择ODS C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流速为0.5 mL/min；流动相为乙腈—水(含0.1%甲酸)混合液(V乙腈∶V水=18∶72)；柱温30 ℃；检测波长335 nm；进样量8 μL[24]。

(2) 标准曲线绘制：精密称取适量异牡荆素—吡喃葡萄糖苷对照品，用流动相(V乙腈∶V水=18∶72，不含甲酸)溶解，配制成1 mg/mL的溶液，依次稀释得10，20，50，100，200，300 μg/mL的对照品溶液。以异牡荆素—吡喃葡萄糖苷溶液浓度为横坐标，所得峰面积为纵坐标，得标准曲线为y=0.643 4x+15.093，R2=0.999。

(3) 牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率的测定：按式(1)计算牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率[25]。

(1)

式中：

W——异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率，%；

c——对应质量浓度，mg/mL；

V——提取液体积，mL；

D——稀释倍数；

m——样品取样量，mg。

1.2.2 单因素试验

(1) 超声功率：固定提取温度40 ℃、料液比1∶15 (g/mL)、超声时间50 min，考察超声功率(100，200，300，400，500 W)对酸枣仁中异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率的影响。

(2) 超声时间：固定乙醇体积分数60%，提取温度40 ℃、料液比1∶15 (g/mL)、提取功率300 W，考察超声时间(30，40，50，60，70 min)对酸枣仁中异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率的影响。

(3) 料液比：固定提取温度40 ℃、乙醇体积分数60%、提取功率300 W、超声时间50 min，考察料液比[1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25 (g/mL)]对酸枣仁中异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率的影响。

(4) 乙醇体积分数：固定提取温度40 ℃、料液比1∶15 (g/mL)、提取功率300 W、超声时间50 min，考察乙醇体积分数(40%，50%，60%，70%，80%)对酸枣仁中异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率的影响。

(5) 超声温度：固定料液比1∶15 (g/mL)、乙醇体积分数60%、提取功率300 W、超声时间50 min，考察提取温度(30，40，50，60，70 ℃)对酸枣仁中异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率的影响。

1.2.3 响应面优化试验 以单因素试验结果为基础[26]，选择超声功率、料液比、超声时间和乙醇体积分数为响应因素，以异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率为响应值，采用Design-Expert 8.0.6 进行四因素三水平的响应面试验以优化异牡荆素—吡喃葡萄糖苷的提取工艺，平行3次。

1.3 数据处理

各指标测定均重复3次，采用Excel 2010进行数据统计处理，使用SPSS 16.0软件进行显著性分析，使用Prism 5.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 超声功率 由图1(a)可知，异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率随超声功率的增大先升高后降低，在超声功率为400 W时最大，在超声功率为500 W时下降至0.527%，可能是超声波空化效应和机械剪切力作用的增强有助于破碎药材的细胞壁，促进目标物的溶出，而超声功率过大会导致局部的高温高压，破坏异牡荆素—吡喃葡萄糖苷的内部结构从而使提取率降低[27-28]。因此选择超声功率300～500 W为佳。

2.1.2 超声时间 由图1(b)可知，当超声时间为60 min时，提取率为0.634%，当超声时间为70 min时，提取率急剧降低至0.407%，可能是因为超声时间过短无法使目标成分充分溶出，而超声时间过长又会破坏异牡荆素—吡喃葡萄糖苷的内部结构[29]，从而使提取率降低。因此，超声时间选择50～70 min为宜。

图1 各因素对异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率的影响

2.1.3 料液比 由图1(c)可知，异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率随乙醇体积的不断增加先升高后降低，当料液比为1∶15 (g/mL)时提取率达到峰值0.604%。这可能是由于料液比的增加使原料与提取液间的接触面积增大，从而提高溶出率；但料液比过高将稀释提取液的浓度，且过多的提取液会分散超声辐射对目标组分的作用，使提取率降低，说明当异牡荆素—吡喃葡萄糖苷浓度达最大值后，料液比的增加反而会使其浓度降低。因此，料液比选择1∶10～1∶20 (g/mL)为宜。

2.1.4 乙醇体积分数 由图1(d)可知，异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率随乙醇体积分数的升高先升高后降低，当乙醇体积分数为70%时提取率最高，这可能与其溶解性有关。当乙醇体积分数较低时，酸枣仁粉末中的异牡荆素—吡喃葡萄糖苷未能完全溶解，随着乙醇体积分数的增大，异牡荆素—吡喃葡萄糖苷溶出得更加完全，但当乙醇体积分数>70%时可能会破坏异牡荆素—吡喃葡萄糖苷的结构，使提取率降低。故乙醇体积分数选择60%～80%为宜。

2.1.5 超声温度 由图1(e)可知，异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率随超声温度的升高先升高后降低，当超声温度为50 ℃时，提取率最高，可能是因为黄酮类化合物具有一定的热敏性[26]，适度的温度有助于目标物的溶出，而温度过高则会破坏目标物致使提取率下降。因此，超声温度选择40～60 ℃为宜。

2.2 响应面法优化

2.2.1 响应面试验结果与分析 在单因素试验的基础上，选择超声功率、超声时间、料液比和乙醇体积分数为响应因素，以异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率为响应值，根据Box-Behnken中心组合原理设计四因素三水平的响应面试验优化酸枣仁中异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取工艺参数，试验因素水平见表1，试验设计与结果见表2。

表1 响应面试验因素水平表

表2 响应面试验设计与结果

2.2.2 模型拟合和显著性分析 通过Box-Benhnken试验拟合得出异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取工艺的回归方程为：

Y=0.71+0.01A+0.013B+0.016C+0.02D-7.5×10-3AB-4.75×10-3AC-2.5×10-3AD+2.5×10-3BC-5.5×10-3BD+5.25×10-3CD-0.062A2-0.032B2-0.042C2-0.016D2。

(2)

由表3可知，回归模型P值<0.000 1，极显著；失拟项P值为0.138 4不显著，说明该试验设计可靠，模型有意义[30]，可对二次回归方程响应值进行预测。一次项B、C、D，二次项A2、B2、C2、D2对异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率影响极显著(P<0.01)，一次项A对异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率影响显著(P<0.05)，表明各因素及因素之间的交互与响应值并非简单的线性关系，二次项对响应值的影响也较大，而各因素之间的交互作用对响应值影响相对较小。比较F值可知，各因素对酸枣仁中异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率的影响程度依次是D>C>B>A，该异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率回归模型的相关系数较高(R2=0.972 8)，模型拟合程度好[31]。因此，可用此模型方程预测异牡荆素—吡喃葡萄糖苷超声提取的结果。

表3 回归模型方差分析†

2.2.3 交互效应分析 由图2可知，随着各因素在一定范围的增大，异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取效果先升高后降低，各因素对异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率影响显著(P<0.05)，但各因素间的交互作用对异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率影响不显著，与方差分析结果一致。

图2 两两因素交互作用对异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率影响的响应面图

2.2.4 最佳提取率验证 由响应面软件分析得到异牡荆素—吡喃葡萄糖苷的最佳提取工艺参数为超声功率405 W，超声时间62.30 min，料液比1∶15.75 (g/mL)，乙醇体积分数76.3%，此条件下预测异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率为0.719%。为便于实际操作，将提取工艺条件修整为超声功率405 W，超声时间60 min，料液比1∶16 (g/mL)，乙醇体积分数75%，该条件下实测异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率为0.705%(n=3)，与预测值的相对误差为2%，表明采用响应面法优化得到的工艺参数基本准确可靠，该试验模型能较好反映出各因素与异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率之间的关系，具有一定的实用价值。

3 结论

采用超声波对酸枣仁黄酮单体异牡荆素—吡喃葡萄糖苷进行提取。结果表明，异牡荆素—吡喃葡萄糖苷的最佳提取工艺条件为超声功率405 W，超声时间60 min，料液比1∶16 (g/mL)，乙醇体积分数75%，该条件下异牡荆素—吡喃葡萄糖苷提取率为0.705%(n=3)，与预测值(0.719%)接近，相对误差为2%。后续可对异牡荆素—吡喃葡萄糖苷进行体内外活性研究。