液相色谱－高分辨率四级杆飞行时间质谱联用法测定保健食品中非法添加的N－去甲基他达拉非

舒 展，王 帅

（浙江省金华市食品药品检验检测研究院，浙江 金华 321000）

·检验检测·

液相色谱－高分辨率四级杆飞行时间质谱联用法测定保健食品中非法添加的N－去甲基他达拉非

舒 展，王 帅

（浙江省金华市食品药品检验检测研究院，浙江 金华 321000）

目的基于高分辨率四级杆飞行时间质谱（QTOF），建立保健食品中N－去甲基他达拉非的检测方法。方法色谱柱为 Agilent Poroshell EC－C18柱（100 mm×4．6 mm，2．7 m），流动相为乙腈－0．1%醋酸，梯度洗脱，流速为0．3 mL／min，柱温为35℃；电喷雾电离（ESI），正离子模式，根据保留时间、精确相对分子质量和二级碎片比对定性。由提取离子流图峰面积与质量浓度关系定量分析N－去甲基他达拉非 ESI质谱的裂解途径。结果N－去甲基他达拉非进样质量浓度在 53～1 060 ng／mL范围内与峰面积线性关系良好（r＝0．999 6），检出限为10．6 ng／mL，定量限为35．0 ng／mL，平均回收率大于97．2%。结论该方法准确、可靠，适用于N－去甲基他达拉非的快速鉴别和定量测定。

液相色谱－四级杆飞行时间质谱；非法添加；N－去甲基他达拉非

5磷酸二酯酶(PDE5）抑制剂主要包括西地那非、伐地那非和他达拉非，主要用于治疗男性勃起功能障碍，但售价较高。为牟取暴利，一些厂家将其非法添加到保健食品中，消费者不知情使用这些产品，可能会引起严重的药品不良反应[1－3]。为此，国家食品药品监督管理总局发布了补充检验方法和检验项目批准件，用于中成药中PDE5抑制剂的检测，以加强监管的力度。为规避检查，一些厂家改为添加新型PDE5衍生物[4－6]，特别是近些年非法添加他达拉非类衍生物[7－12]的情况尤为严重，如非法添加N－去甲基他达拉非[13]。由于发现时间不长，目前仍缺少相应的定性定量分析方法。为此，本研究中采用液相色谱－高分辨率四级杆飞行时间质谱联用法对保健食品中的N－去甲基他达拉非进行了检测和分析，以期建立快速、准确的检验方法。

1 仪器与试药

1．1 仪器

Agilent 6530型 HPLC－QTOF液质联用仪（美国Agilent公司）；Mettler XS205DU型电子天平（瑞士梅特勒公司）；KQ－200KDB型超声仪（昆山市超声仪有限公司）；Direct－PureUP 20型超纯水系统（上海乐枫生物科技有限公司）

1．2 试药

N－去甲基他达拉非对照品（Toronto Research Chemicals公司，批号 19－MVI－126－1）；西地那非（批号1358－057A1），他达拉非（批号1156－051A1），那红地那非（批号 1591－080A3），红地那非（批号1947－006B2），氨基他达拉非（批号 1638－004A2），羟基豪莫西地那非（批号1441－048A6），伐地那非盐酸盐（批号 1132－035A1），豪莫西地那非（批号1220－030A3），伪伐地那非（批号 1217－011A2），硫代艾地那非（批号1214－006A3），那莫西地那非（批号1646－055A2），均购于加拿大 TLC Pharma Chem公司。乙腈（色谱纯，德国Merck公司，批号JA042430）；冰醋酸（色谱纯，阿拉丁试剂有限公司，批号E1519047）；样品为我研究院日常抽检品（均为标注有增强免疫等功能的保健品）。

2 方法与结果

2．1 仪器工作条件

色谱条件：色谱柱为 Agilent Poroshell EC－C18柱（100 mm×4．6 mm，2．7 μm）；流动相A为0．1%的乙酸溶液，B为乙腈，梯度洗脱（0～15 min，25%～40%B；15～20 min，40%～80%B；20～30 min，80%B）；流速为0．3 mL／min；柱温为40℃。

质谱条件：采集模式，正离子模式；扫描范围，m／z 50～1 000；离子源为电喷雾电离（ESI）源；雾化气（N2），35 psi（1 psi＝6．895 kPa）；干燥气（N2），流速12 L／min；温度350℃；毛细管电压3．5 kV；碎裂电压180 V；二级质谱碰撞池能量25 eV。

2．2 溶液制备

标准品贮备液：称取N－去甲基他达拉非对照品10．60 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加乙腈使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准品贮备液。

混合对照品溶液：取12种PDE5型抑制剂各10 mg，置10 mL容量瓶中，用乙腈使溶解并稀释至刻度，摇匀，50%乙腈稀释至500 ng／mL，即得。

供试品溶液：取样品1．0 g置50 mL容量瓶中，加入乙腈约15 mL，超声溶解，乙腈稀释至刻度，过滤，取1 mL置100 mL容量瓶中，用50%乙腈稀释至刻度，作为供试品溶液。

2．3 质谱行为分析

取N－去甲基他达拉非标准品贮备液，用50%乙腈稀释成质量浓度为530 ng／mL的对照品溶液，按拟订条件测定。其一级、二级质谱图见图1和图2。由于结构中的氮原子，N－去甲基他达拉非易与H＋结合形成准分子离子[M＋H]＋。定性筛查时应注意，除[M＋H]＋外，N－去甲基他达拉非还能与Na形成[M＋Na]＋离子。

2．4 定量分析

图1 N－去甲基他达拉非一级质谱图

图2 N－去甲基他达拉非二级质谱图

采用B04．00版Mass Hunter软件，按精确相对分子量376．129 2提取色谱图进行定量，提取质量窗口为5×10－6。

2．5 色谱质谱条件优化

2．5．1 流动相选择

参考国家食品药品监督管理总局药品检验补充检验方法和检验项目批准件（编号为2009030）中检测方法，考察了水－乙腈、10 mmol／L乙酸铵溶液－乙腈、0．1%乙酸溶液－乙腈流动相体系对分离效果及质谱灵敏度的影响。结果，采用0．1%乙酸溶液－乙腈流动相体系不仅具有较好的峰形及质谱响应，同时能与批准件规定的11种PDE5型抑制剂分离见图3，从而提高工作效率。

2．5．2 毛细管出口电压优化

随着毛细管出口电压（Fragmentor）的增加，N－去甲基他达拉非的[M＋H]＋离子响应也逐渐增加，但随后发生源内裂解，离子响应逐渐减小。采用100～200 V的毛细管出口电压测定（每隔10 V增加），将毛细管出口电压设定为150 V时，[M＋H]＋离子具有最高的响应值。

2．5．3 碰撞裂解能优化

他达拉非类物质较易裂解。采用10，15，20，25，30 eV的碰撞裂解能进行测定，结果碰撞裂解能为25 eV时，裂解碎片细节最丰富，有利于对N－去甲基他达拉非进行裂解途径的归纳和鉴别测定，故将碰撞裂解能量设定为25 eV。

2．6 裂解规律推测

图3 12种对照品提取离子色谱图

图4 N－去甲基他达拉非的裂解途径及主要碎片离子

基于精确相对分子量的二级质谱图（图2），推测N－去甲基他达拉非可能的裂解途径（图4）：先脱去胡椒环形成 m／z为254．092 4的碎片，然后失去羰基，形成 m／z为226．097 5的碎片。这一碎片离子在开环后极不稳定，随后脱去HCN和另一个羰基，形成稳定的m／z为169．076 0的碎片[8]。N－去甲基他达拉非的另一裂解途径为通过反Diels－Alder反应得到的 m／z为262．086 3碎片离子。

2．7 方法学考察

线性关系考察：将标准品贮备液用50%乙腈稀释成质量浓度分别为53，106，212，530，1 060 ng／mL的对照品溶液，按拟订条件测定，以母离子的峰面积（Y）对相应的质量浓度（X）进行线性回归，得回归方程 Y＝1 719．9X＋29 949，r＝0．999 8（n＝5）。结果表明，N－去甲基他达拉非质量浓度在53～1 060 ng／mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：取N－去甲基他达拉非对照品溶液（212 ng／mL），按拟订条件连续测定5次，以母离子峰面积计算精密度。结果的 RSD为2．73%（n＝5），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取N－去甲基他达拉非对照品溶液（212 ng／mL），按拟订条件分别于0，2，4，8，12 h时测定母离子峰面积。结果的 RSD为2．88%（n＝5），表明溶液在12 h内稳定。

重复性试验：取能检测出N－去甲基他达拉非的样品，依法平行制备供试品溶液6份，按拟订条件进样测定。结果N－去甲基他达拉非母离子峰面积的 RSD为2．30%（n＝6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：精密称取未检测出N－去甲基他达拉非的样品1 g，置50 mL容量瓶，分别精密加入N－去甲基他达拉非对照品贮备溶液2，5，8 mL，加乙腈稀释至刻度，50%乙腈稀释400倍，每个质量浓度平行制备3份，按上述条件测定，计算回收率。结果见表1。

检出限与定量限确定：取标准贮备液，稀释后测定，结果检出限为 10．60 ng／mL（S／N＝3），定量限为35．00 ng／mL（S／N＝10）。

表1 N－去甲基他达拉非在不同质量浓度下的回收率

图5 阳性样品提取离子色谱图

图6 阳性样品二级质谱图

2．8 样品测定

按拟订条件进样测定，测定样品5批，其中一批样品中提取出与对照品保留时间相同的提取离子流色谱峰（图5），其准分子离子峰[M＋H]＋m／z值为376．128 4（理论 m／z 376．129 2，Δm＝－2．1×10－6），二级质谱图一致（图6）。测定含量为5．26 mg／g。

3 讨论

高分辨质谱检测器具有高分辨率和高选择性，在缺少对照品的情况下根据精确分子质量及裂解规律也能进行化合物的快速筛查。由于他达拉非类物质的结构修饰主要集中在哌嗪二酮的N原子上，根据N－去甲基他达拉非的裂解规律可推测在裂解过程中均能产生 m／z分别为169．076 0（C11H9N2）、262．086 3（C17H12NO2）这2个特征碎片离子[14－15]。实际工作中可根据特征离子快速筛查他达拉非类物质，再结合裂解规律推测化合物的最终结构，从而实现对非目标物质的筛查。

非法添加样品的添加剂量具有不确定性，有时有必要对样品进行再稀释。当对照品与供试品的质量浓度较高时会产生较强的残留，需对质谱系统进行较长时间冲洗，以免出现不必要的假阳性。

N－去甲基他达拉非作为一种新型的 PDE5抑制剂，目前仍缺少成熟的检验方法，监管上存在漏洞，让不法商家有机可乘。本研究中采用液相色谱－高分辨率四级杆飞行时间质谱联用法对N－去甲基他达拉非进行了定性定量测定，并对裂解途径进行了推断。在没有对照品的情况下也可对其进行快速鉴定筛查，也能用于推断同类新型衍生物的结构推断，为打击非法添加提供了有力的技术支持。

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Determination of N－Desmethyltadalafil Illegally Added in Dietary Supplements by HPLC－QTOF

Shu Zhan，Wang Chengshuai
（Jinhua Institute for Drug and Food Control，Jinhua，Zhejiang，China 321000）

Objective To establish the high－resolution quadrupole－time－of－flight mass spectrometry（QTOF）method for determining the N－Desmethyltadalfi illegally added in dietary supplements．M ethods The analysis was performed on an Agilent Poroshell EC－C18column（100 mm×4．6 mm，2．7 m）with 0．1% acetic acid－acetonitrile as mobile phase，and the flow rate was 0．3 mL／min，gradient elution，with the column temperature 35 ℃．QTOF MS equipped with ESI ion source was performed in positive ionization mode．Qualitative analysis was based on the retention time，accurate mass，and the product ions．Quantitative analysis was performed by using the peak area and concentration．Results The ESI－MS fragmentation behavior was characterized．Good linearity was obtained in the range of 53－1 060 ng／mL(r＝0．999 6)．The LOD was 10．6 ng／mL and LOQ was 35．0 ng／mL，the recoveries were more than 97．2%．Conclusion The method is sensitive，accurate，and can be used in the qualitative and quantitative analysis of N－Desmethyltadalafil illegally added in dietary supplements．

HPLC－QTOF；illegal additives；N－desmethyltadalafil

R927．1

A

1006－4931(2017)04－0022－05

2016－10－13；

2016－11－17)

10．3969／j．issn．1006－4931．2017．04．006

舒展（1984－），男，浙江金华人，硕士研究生，主管药师，主要从事药物分析工作，（电话）0579－82301374（电子信箱）185161587＠163．com。