姜黄素对宫颈癌干细胞增殖、聚集及化疗敏感性的影响

张燕华，高艳娥，臧睿，杨红梅

(1西安630医院，西安710000；2西安交通大学第二附属医院)

姜黄素对宫颈癌干细胞增殖、聚集及化疗敏感性的影响

张燕华1，高艳娥2，臧睿1，杨红梅1

(1西安630医院，西安710000；2西安交通大学第二附属医院)

目的探讨姜黄素对宫颈癌干细胞增殖、聚集及化疗敏感性的影响。方法用流式细胞术从人宫颈癌细胞株CASKI中分选CD133+的宫颈癌干细胞。将宫颈癌干细胞随机分为七组，CC10组、CC20组、CC40组、CC60组、CC80组及CC100组分别给予终浓度为10、20、40、60、80、100 mg/mL姜黄素进行培养，对照组给予等量溶剂与培养基培养。用MTT法检测各组细胞增殖抑制率。取对照组、CC60组细胞用无血清培养基培养1周，光镜下计数聚集的直径大于100 μm的干细胞球个数，流式细胞术检测宫颈癌干细胞比例。取宫颈癌干细胞随机分为BV组、CC组、BV+CC组、对照组四组，分别加入10 mg/mL贝伐单抗、60 mg/mL姜黄素、10 mg/mL BV+60 mg/mL姜黄素、等量溶剂与培养基，培养48 h后采用流式细胞术测算细胞凋亡率。结果CC10组、CC20组、CC40组、CC60组、CC80组、CC100组细胞增殖抑制率均高于对照组(P均<0.05)；且随着姜黄素浓度的增加，宫颈癌干细胞增殖抑制率逐渐升高(P均<0.05)。CC60组直径大于100 μm的干细胞球个数少于对照组(P<0.05)，干细胞比例低于对照组(P<0.05)。BV+CC组细胞凋亡率高于对照组、BV组、CC组(P均<0.05)，CC组高于对照组、BV组(P均<0.05)，BV组高于对照组(P均<0.05)。结论姜黄素可抑制宫颈癌干细胞增殖，降低其聚集能力，增加其对贝伐单抗的治疗敏感性。

宫颈癌；宫颈癌干细胞；姜黄素；细胞增殖；细胞聚集；贝伐单抗；治疗敏感性

宫颈癌是发病率仅次于乳腺癌的女性恶性肿瘤，其发病率逐年升高，且发病年龄呈现年轻化趋势[1]。目前宫颈癌新药的研发多侧重于预防。虽然传统放化疗可部分提高宫颈癌患者的生存率、改善患者预后，但仍无法有效控制宫颈癌的复发、转移及治疗耐药[2，3]。贝伐单抗为一种人源单克隆抗体，可通过抑制血管内皮生长因子的活性而抑制血管生成。贝伐单抗单用或与其他化疗药物联用可减少肿瘤血管生成，治疗转移性或复发性宫颈癌疗效显著，但易耐药[4，5]。肿瘤干细胞是一类富有广泛增殖和形成肿瘤能力的细胞，是肿瘤发生复发、转移及治疗耐药的根本原因[6，7]。研究显示，宫颈癌干细胞具有极强的自我更新、不断增殖和体内成瘤能力。CD133+是常见的宫颈癌干细胞流式分选的分子标志物[8]。姜黄素是从姜黄根茎提取物中分离得到的一种多酚类化合物，具有显著的抗肿瘤作用，可抑制转移性宫颈癌细胞增殖迁移、促进细胞凋亡、降低宫颈癌细胞的体内成瘤能力[9，10]。但关于姜黄素对宫颈癌干细胞的作用鲜有报道。2015年7月～2017年5月，本研究探讨姜黄素对宫颈癌干细胞增殖、聚集和化疗敏感性的影响，以期为宫颈癌的复发、转移、治疗耐药提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料来源 人宫颈癌细胞CASKI(用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养，置于37 ℃、饱和湿度、含5%CO2的培养箱内孵育，贴壁后用流式细胞仪分选CD133+的宫颈癌干细胞)由中国科学院上海生命科学院生化细胞所提供。姜黄素液(按2 g/mL溶于二甲基亚砜后保存于4 ℃冰箱，使用时用培养基分别稀释成10、20、40、60、80和100 mg/mL)购于美国Sigma公司。贝伐单抗(按10 mg/mL溶于二甲基亚砜后保存于4 ℃冰箱)购于Roche公司；FITC标记CD133抗人抗体购于美国BD公司；细胞培养所用的试剂均购于美国Gibco公司。Annexin V-FITC/PI双染凋亡检测试剂盒购于江苏凯基生物技术股份有限公司；Multiskan Ascent酶标仪(型号413MBY042078)、奥林巴斯倒置显微镜购于日本Olympus公司，BD FACSAriaTM流式细胞分选仪购于美国BD公司。

1.2 宫颈癌干细胞增殖能力检测 采用MTT法。将宫颈癌干细胞随机分为七组，CC10组、CC20组、CC40组、CC60组、CC80组及CC100组分别给予终浓度为10、20、40、60、80、100 mg/mL姜黄素，对照组给予培养基，继续培养48 h。取各组细胞以1×103/孔接种于低吸附的96孔板中，每组设置5个复孔，细胞汇合度接近90%时，每孔加入灭菌MTT液30 μL。37 ℃孵育4 h后每孔中加入DMSO 150 μL，低速振荡10 min。用酶标仪检测490 nm波长处各孔的吸光度(A)值。计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=(1-实验组A值)/对照组A值×100%。实验重复3次，取平均值。计算姜黄素对宫颈癌干细胞的半数抑制浓度(IC50)，IC50=57.23 mg/mL。

1.3 宫颈癌干细胞聚集能力检测 采用流式细胞术。取对照组、CC60组(因60 mg/mL最接近姜黄素的IC50)细胞用无血清养基悬浮培养1周富集宫颈癌干细胞。无血清培养基由DMEM-F12(1∶1)500 mL、B27(1∶50)10 mL、20 ng/mL表皮生长因子1 mL、20 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子500 μL组成。200倍奥林巴斯倒置显微镜(OLYMPUS IX71)下观察细胞聚集成球情况。随机取3个视野进行拍照，统计直径大于100 μm的干细胞球个数，取平均值。采用流式细胞术检测宫颈癌干细胞比例。

1.4 宫颈癌干细胞贝伐单抗敏感性检测 采用流式细胞术。将宫颈癌干细胞随机分为BV组、CC组、BV+CC组、对照组，分别加入终浓度10 mg/mL贝伐单抗、60 mg/mL姜黄素、10 mg/mL BV+60 mg/mL姜黄素、培养基。培养48 h后采用流式细胞术测算细胞凋亡率。操作按流式细胞仪说明书进行。以上重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 姜黄素对宫颈癌干细胞增殖能力的影响 对照组、CC10组、CC20组、CC40组、CC60组、CC80组、CC100组细胞增殖抑制率分别为27.52%±2.68%、40.18%±1.70%、47.41%±1.68%、55.49%±1.98%、77.02%±3.55%、93.02%±1.40%。CC10组、CC20组、CC40组、CC60组、CC80组、CC100组细胞增殖抑制率均高于对照组(P均<0.05)。且随着姜黄素浓度的增加，宫颈癌干细胞增殖抑制率逐渐升高(P均<0.05)。

2.2 姜黄素对宫颈癌干细胞聚集的影响 对照组、CC60组直径大于100 μm的干细胞球个数分别为143、84个/视野。CC60组直径大于100 μm的干细胞球个数少于对照组(P<0.05)；对照组、CC60组宫颈癌干细胞比例分别为3.47%±0.06%、1.23%±0.09%，CC60组宫颈癌干细胞比例低于对照组(P<0.05)。

2.3 姜黄素对宫颈癌干细胞贝伐单抗敏感性的影响 BV组、CC组、BV+CC组、对照组细胞凋亡率分别为4.63%±0.47%、37.70%±1.09%、53.44%±1.98%、0.00 17%±0.00 07%。BV+CC组细胞凋亡率高于对照组、BV组、CC组(P均<0.05)，CC组高于对照组、BV组(P均<0.05)，BV组高于对照组(P均<0.05)。

3 讨论

研究显示，肿瘤干细胞是维持肿瘤细胞生长的根本原因[6]，其具有先天耐药性，是导致肿瘤复发和转移的重要原因[7]。因此肿瘤干细胞是肿瘤治疗的重要靶标，寻找可直接或间接作用于肿瘤干细胞的药物是治疗肿瘤的有效策略。CD133是宫颈癌、前列腺和黑素瘤等多种肿瘤的肿瘤干细胞标志之一[8]。因此，本研究以CD133为分子标志物分选宫颈癌干细胞，后经无血清悬浮培养法富集宫颈癌干细胞。

药理学研究显示，姜黄素具有抗肿瘤和杀灭肿瘤干细胞的作用[11]，可增加直肠癌CD133+肿瘤干细胞的放疗敏感性[12]，姜黄素可抑制肝癌细胞增殖，并可通过调控信号传导与转录激活因子3的磷酸化而干预肝癌干细胞标志物的表达[13]。本研究结果显示，随着姜黄素浓度的增加宫颈癌干细胞增殖抑制率逐渐升高，与姜黄素对肺癌干细胞的增殖抑制作用类似，说明姜黄素也可抑制宫颈癌干细胞的增殖。本研究还发现，姜黄素可显著降低宫颈癌干细胞成球能力，该结果与相关研究[13]类似。表明姜黄素在宫颈癌干性维持中发挥重要作用，可能抑制宫颈癌的复发、转移。

贝伐单抗是治疗复发性宫颈癌的有效药物，但使用范围仍有局限性，且已有研究显示部分患者对贝伐单抗耐药[4，5]。本研究检测贝伐单抗单独使用、姜黄素单独使用、贝伐单抗联合姜黄素使用时宫颈癌干细胞的凋亡率，结果经贝伐单抗联合姜黄素组干预的细胞凋亡率最高，该结果与相关研究[12]具有相似性。说明姜黄素也可增加宫颈癌干细胞对贝伐单抗治疗的敏感性，可能具有抑制宫颈癌干细胞耐药的作用。

综上所述，姜黄素可显著抑制宫颈癌干细胞的增殖和成球能力，并可增强宫颈癌干细胞对贝伐单抗的治疗敏感性。姜黄素可能在宫颈癌干细胞的干性维持、宫颈癌的复发、转移和治疗耐药中发挥重要作用，有潜力成为宫颈癌治疗的辅助药物。

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Effectsofcurcuminoncellproliferation,aggregation,andchemosensitivityofcervicalcancerstemcells

ZHANGYanhua1,GAOYan'e,ZANGRui,YANGHongmei

(1Xi'an630Hospital,Xi'an710000,China)

ObjectiveTo explore the effects of curcumin on the cell proliferation, aggregation, and the sensitivity to bevacizumab of cervical cancer stem cells.MethodsThe CD133+cervical cancer stem cells (CCSCs) were isolated from CASKI cells by flow cytometry. The CCSCs were divided into seven groups: CC10 group, CC20 group, CC40 group, CC60 group, CC80 group, and CC100 group which were given a final concentration of 10, 20, 40, 60, 80 and 100 mg/mL curcumin, while cells in the control group were given the same amount of solvent and culture medium. The inhibition rate of cell proliferation in each group was detected by MTT. The cells in the control group and CC60 group were cultured in serum-free medium for 1 week. The number of stem cell spheres with diameter greater than 100 μm was counted by light microscope, and the proportion of CD133+cells was detected by flow cytometry. The cervical cancer stem cells were divided into four groups, BV group (added with bevacizumab 10 mg/mL), CC group (added with 60 mg/mL curcumin), BV+CC group (added with 10 mg/mL bevacizumab and 60 mg/mL curcumin), and the control group (treated with the same amount of solvent and medium). After 48-hour culture, the apoptosis rate was determined by flow cytometry.ResultsThe rates of cell proliferation inhibition in the CC10 group, CC20 group, CC40 group, CC60 group, CC80 group, and CC100 group were higher than that of the control group (allP<0.05), and with the increase of curcumin concentration, the proliferation inhibition rate of cervical cancer stem cells gradually increased (allP<0.05). The number of stem cell spheres with diameter greater than 100 μm of the CC60 group was less than that of the control group (P<0.05). The proportion of cervical cancer stem cell in the CC60 group was lower than that in the control group (P<0.05). The apoptosis rate in the BV+CC group was higher than that in the control group, BV group, and CC group (P<0.05), the apoptosis rate in the CC group was higher than that in the control group and BV group (P<0.05), and the apoptosis rate in the BV group was higher than that in the control group (P<0.05).ConclusionCurcumin can inhibit the proliferation and decrease the stem cell aggregation of CCSCs and increase the sensitivity of CCSCs to bevacizumab.

cervical carcinoma; cervical cancer stem cells; curcumin; cell proliferation; cell aggregation; bevacizumab; treatment sensitivity

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.37.005

R737.33

A

1002-266X(2017)37-0015-03

陕西省自然科学基金资助项目(2016JM8067)。

张燕华(1969-)，女，副主任医师，主要研究方向为妇科肿瘤及妇科内分泌。E-mail：xi_an630@qq.com

2017-07-08)