多索茶碱缓释片在Beagle犬体内药代动力学研究

郭泉

摘要：目的 进行受试制剂多索茶碱缓释片与参比制剂多索茶碱片在Beagle犬体内的药代动力学研究，明确其是否具有缓释特征，为临床研究提供依据。方法 采用两制剂两周期交叉试验方法，12只Beagle犬分别经口给予受试制剂和参比制剂400 mg，采用LC-MS法测定各时间点血浆中多索茶碱的浓度，药代动力学参数经DAS 2.0 统计软件计算获得。结果 受试制剂与参比制剂药代动力学参数：Cmax分别为（4.9±0.6） 和（8.4±2.1）μg/mL，Tmax分别为（2.5±0.5）和（1.7±0.4）h，T1/2分别为（1.4±0.4）和（1.0±0.3）h，AUC0-12分别为（14.0±1.7）和（14.4±2.9）μg/mL×h。受试制剂在达峰浓度上明显小于参比制剂，达峰时间延迟，半衰期延长，具有缓释制剂特征。结论 受试制剂多索茶碱缓释片具有缓释特征。

关键词：多索茶碱；Beagle犬；药代动力学；缓释；液相色谱-串联质谱

Pharmacokinetic Studies of Doxofylline Sustained Release Tablets in Beagles

GUO Quan

（The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233004，Anhui，China）

Abstract：Objective To study the pharmacokinetics of Doxofylline Sustained Release Tablets and Doxofylline Tablet in Beagles. Methods A total of 12 male Beagles were randomly divided into two groups. They were assigned to receive Doxofylline Sustained Release Tablets （trial preparation） and Doxofylline Tablets （reference preparation） respectively. The plasma of Doxofylline were detected by LC-MS method after oral administration of 400mg. The pharmacokinetic parameters were calculated by the procedure of DAS 2.0. Results The Cmax of the two preparations were （4.9±0.6） and （8.4±2.1）μg/mL， Tmax were （2.5±0.5） and （1.7±0.4）h， T1/2 were （1.4±0.4） and （.0±0.3）h， AUC0-12 were （14.0±1.7） and （14.4±2.9）μg/mL*h. Trial preparation was significantly less than reference preparation in the peak concentration， while tmax and half-life was prolonged. Conclusion Doxofylline Sustained Release Tablets （trial preparation） was characterized by slow drug releasing.

Key words：Doxofylline； Beagles； pharmacokinetics； Sustained Release Tablet； LC-MS

多索茶碱（doxofylline）是一种新型平喘镇咳药，直接作用于支气管和肺血管平滑肌，扩张支气管和肺血管。多索茶碱通过抑制平滑肌细胞内磷酸二酯酶起作用，增加细胞内cAMP水平，从而松弛平滑肌。高浓度多索茶碱可抑制细胞内组胺的释放。与传统药物茶碱和氨茶碱相比，疗效高且毒性低，治疗效果是氨茶碱的10～15倍[1-2]。多索茶碱国内现有剂型有片剂、胶囊剂和注射剂，均为速释型制剂，未见缓释制剂上市，本品多索茶碱缓释片采用亲水凝胶骨架技术，延缓多索茶碱的释放，延长多索茶碱在体内的半衰期，从而达到给药期间有效保持有效血药浓度，减小血药浓度峰谷波动，增加治疗指数的目的。

该研究参照《化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则》[3]要求，通过LC-MS法观察多索茶碱缓释片在Beagle犬体内药代动力学情况，以了解多索茶碱缓释片在Beagle犬体内吸收规律，为其进一步研究与开发提供实验依据。

1 资料与方法

1.1实验动物 Beagle犬普通级，10.0～12.0 kg，共12只，雄性，购于苏州工业园区爱尔麦特科技有限公司。

1.2仪器与试剂 LC/MS-2010EV液相质谱联用仪（日本岛津公司）；XW-80A微型旋涡混合仪（上海沪西分析仪器厂）；XS105分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；Milli-Q Academic纯水机（上海密理博贸易有限公司）；KQ-250E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HGC-24型氮吹仪（北京瑞邦興业科技有限公司）；16K平衡离心机（珠海黑马医学仪器有限公司）。

多索茶碱缓释片（规格：400 mg/片，批号：20090406，合肥合源药业有限公司）；多索茶碱片（规格：200 mg/片，批号：081201，黑龙江福和华星制药集团股份有限公司）；多索茶碱标准品（批号：100625-200301，中国药品生物制品检定所购买）；内标卡马西平标准品（批号：100142-199503，中国药品生物制品检定所购买）；甲醇（色谱纯，Merck公司）、乙腈（色谱纯，Merck公司）；乙酸乙酯（分析纯，广东汕头市西陇化工厂）；水为自制纯化水。

1.3方法

1.3.1色谱与质谱条件 色谱条件：色谱柱：Phenomenex Syneryi 4μ POLAR-RP 150×2.0 mm；流动相：甲醇∶水（0.1%甲酸）=72∶28（V∶V），流速：0.2 ml/min，柱温：35℃；进样量：10 μl。质谱条件：ESI离子源；CDL Temperature 250℃，Heat Block Temperature 200℃，Detector Voltage 1.7 KV；正离子方式检测，扫描方式为选择离子检测（SIM），用于定量的离子分别为多索茶碱m/z：267.0；内标卡马西平m/z：237.2，扫描时间：1.00 s。

1.3.2试验设计 12只Beagle犬随机分为两组，采用双周期两制剂双交叉试验设计，第一组先服用受试制剂后服用参比制剂，第二组先服用参比制剂后服用受试制剂。服药前禁食过夜（12 h以上），于给药当日清晨空腹经口给予受试制剂多索茶碱缓释片1片或参比制剂多索茶碱片2片，并用100 ml温开水灌送，分别于给药前（0 h）和給药后10 min、20 min、 30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、 10 h、12 h从犬后肢静脉取血2 ml，放入试管中，静置30 min左右，3000 rpm离心15 min，取血浆于离心管中，-70℃冷冻待测。服药后2 h可饮水；间隔1 w两组交叉服药，第二周期采血时间点与第一周期相同。

1.3.3样品处理方法 精密量取血浆100 μl置于空白离心管中，加入内标卡马西平溶液（1.515 μg/ml）10 μl，涡旋30 s，再加入1 ml乙酸乙酯，涡旋3 min，14000 rpm离心10 min，提取有机层，N2下吹干，500 μl流动相复溶，10 μl进样。

1.4统计学处理 标准曲线采用线性回归分析，药代动力学参数采用DAS 2.0软件计算。

2 结果

2.1方法学验证

2.1.1专属性 取空白血浆，除不加内标外，按1.3.3项下操作，获得空白样品色谱图；将一定浓度多索茶碱标准溶液和内标溶液加入Beagle犬空白血浆中，同法操作，获得相应的色谱图；同法得到Beagle犬给药后血浆样品色谱图。多索茶碱保留时间为4.7 min，内标卡马西平保留时间为4.5 min。在色谱条件下，Beagle犬组织匀浆中内源性物质不干扰多索茶碱及内标的测定。血浆典型色谱图，见图1。

2.1.2标准曲线 精密吸取不同浓度的多索茶碱及内标工作液各10 μl，加入不同体积空白血浆，混匀，按1.3.3项下方法处理制备标准曲线。以血浆浓度（Y）为纵坐标，以样品峰面积与内标峰面积的比值（X）作为横坐标，用加权最小二乘法（W=1/X2）进行线性回归运算，在0.026～13.312 μg/ml线性范围内，回归方程为Y=0.99X+0.003，r=0.99（n=3），定量下限为0.026 μg/ml。

2.1.3 精密度 按1.3.3 项下方法处理制备高、中、低3个浓度（分别为0.052，0.416和6.656 μg/ml）的多索茶碱样品，平行操作6份，于同1 d内测定3次，计算日内精密度；连续测定3 d，计算日间精密度。不同浓度多索茶碱日内精密度RSD分别为0.81%～6.30%；日间精密度RSD分别为3.19%～7.12%，符合要求。

2.1.4 提取回收率与基质效应 按1.3.3 项下方法处理制备高、中、低3个浓度的多索茶碱样品，平行操作3份，以处理后的样品色谱峰面积与相应浓度的未经处理的样品色谱峰面积之比，考察方法的提取回收率；以空白血浆处理后再加入标准溶液所得色谱峰面积与相应浓度的未经处理的样品色谱峰面积之比考察基质效应。结果显示多索茶碱及内标提取回收率分别为80.25%～86.67%、81.07%～86.54%，基质效应分别为80.78%～99.23%、86.20%～96.57%；RSD值均<10%，符合要求。

2.1.5稳定性 按1.3.3项下方法处理制备高、中、低3个浓度的多索茶碱样品，平行操作，分别考察在室温放置24 h、室温放置8 h再处理、反复冻融3次、长期冷冻66 d条件下的稳定性。结果显示RSD值均<10%，样品在上述条件下均稳定。

2.1.6样品测定过程中的随行标准曲线及质量控制 为减少系统误差，在进行样品分析时，每个分析批均建立随行标准曲线计算血药浓度，并测定质控样品（分别为0.052，0.416和6.656 μg/ml），质控样本数不低于待测样本的5%，确保计算得到的药物浓度准确可靠。

2.2 Beagle犬药代动力学研究 Beagle犬经口给予多索茶碱后，受试制剂多索茶碱缓释片和参比制剂多索茶碱片后的平均血药浓度-时间曲线图，见图2，多索茶碱血药浓度用DAS 2.0软件统计相应药代动力学参数结果，见表1。

血药浓度-时间曲线图（n=12）

注：T：受试制剂多索茶碱缓释片平均血药浓度-时间曲线；R：参比制剂多索茶碱片平均血药浓度-时间曲线。

受试制剂和参比制剂的ln（AUC0-12）经方差分析表明两制剂间无显著性差异，经双向单侧t检验，两制劑的[1-2α]置信区间为87.9%～110.2%，表明多索茶碱缓释片在吸收程度上具有生物等效性；受试制剂和参比制剂ln（Cmax）经方差分析，P<0.05，说明两制剂间存在显著性差异，经双向单侧t检验，两制剂的[1-2α]置信区间为51.9%～68.0%，表明多索茶碱缓释片在达峰浓度上明显小于普通片；受试制剂和参比制剂ln（MRT）经方差分析，P<0.05，说明两制剂间存在显著性差异，受试制剂MRT较参比制剂延长。Tmax经非参数检验，P<0.05，表明两制剂间存在显著性差异，符合药物制剂的特点，受试制剂与参比制剂比较，具有缓释特征。

3 讨论

支气管哮喘属于变态反应性疾病，属于呼吸内科常见病、多发病，尤其在冬春季节高发，严重影响患者呼吸功能呈现昼轻夜重的表现，而对于支气管哮喘临床常用方法就是应用支气管扩张剂，扩张支气管以减轻哮喘症状[2-3]。近年来，随着多索茶碱的临床应用，发现多索茶碱对于支气管哮喘患者来说，患者反应疗效更好。多索茶碱是茶碱的衍生物，为新型的非腺苷阻断性支气管扩张剂，大量临床前药理毒理试验表明，多索茶碱抗支气管痉挛作用明显强于茶碱，心血管系统、消化系统及其它系统的药理作用明显低于茶碱[4]。

患者服用多索茶碱普通口服制剂后，多索茶碱口服吸收快[7]，患者体内血药快速上升，经体内代谢后血药浓度又快速下降，造成血药浓度波动大，出现明显的血药浓度“峰谷”现象，从而影响安全性和疗效；必须对制剂的释药速度进行控制，否则无法保证治疗期间维持有效血药浓度。在多索茶碱一日总剂量相同的情况下，多索茶碱缓释片的给药方案较普通片更易达到稳态血药浓度；缓慢释药使血药浓度更加平稳，有效血药浓度持续时间长，从而避免了普通制剂的“峰谷”现象。同时多索茶碱缓释片的开发减少了患者的给药次数，能明显提高患者的顺应性，特别适用于需长期用药的慢性疾病患者。

多索茶碱普通制剂检测多采用液相法[5-6]，在检测限方面有一定局限性。本研究采用LC-MS测定Beagle犬血浆浓度，灵敏度高，最低检测浓度可至0.026 μg/ml。文献中生物样品预处理方法多使用二氯甲烷、氯仿提取，毒性大，且氯仿萃取過程中容易发生乳化。本研究采用乙酸乙酯萃取，降低了有机试剂的毒性。

本研究中受试制剂多索茶碱缓释片在Beagle犬体内药代动力学试验研究表明受试制剂有一定的缓释特征，其动物体内药动学参数为后续临床研究提供了参考依据，有一定的研究价值。

参考文献：

[1]国家食品药品监督管理局.化学药物非临床药代动力学研究技术指导原则[H]GPT5-1.2005-03.

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[3]张建华.支气管哮喘的流行病学及高危因素，实用儿科临床杂志，2007，23（4）：241-243.

[4]王文勇，等.治疗哮喘新药多索茶碱[J].黑龙江医药，2001，14（5）：379-380.

[5]顾健，张春燕，曹兆龙，等.多索茶碱片在中国人的药代动力学研究[J].中国新药杂志，2000，9（6）：396-398.

[6]阚全程，李朵璐，师秀琴.HPLC测定慢性阻塞性肺疾病患者血清中多索茶碱浓度及其药动学研究[J].药物分析杂志，2009，29（5）：845-848.

编辑/肖慧